背景:乳腺包裹性乳头状癌(Encapsulated papillary carcinoma,EPC)是乳腺癌中一种少见的肿瘤亚型,占乳腺癌的0.2-0.5%,常见于绝经后期的老年女性。绝大多数EPC为中低级别病例,中低级别EPC具有独特的临床病理特点,远处转移和复发的报道较少具有较好的预后。肌上皮免疫组化染色证实EPC与浸润癌更为类似,目前将中低级别EPC认为是一种介于原位癌与浸润癌之间的癌症类型。近年来高级别EPC逐渐被病理学家所认识,单纯性高级别EPC可能出现远处转移并且引起患者死亡,其临床病理特征较中低级别恶性程度更高且预后不良,但是高级别EPC与中低级别EPC临床病理特征具体差异仍不清楚,且中国人群EPC研究很少。此外,为了比较EPC与原位癌和浸润癌在分子特征上的差异,研究人员通过拷贝数变异分析和基因组变异分析的方法,最终获得的结果并不一致。目前EPC的分子遗传特征和发病机制目前仍知之甚少。第一部分:乳腺高级别EPC与中低级别EPC间临床病理特征差异的比较实验目的:乳腺高级别EPC与中低级别EPC间临床病理特征差异的比较,为诊断和认识高级别EPC提供更多信息,同时结合己有文献报道进行了文献复习。材料与方法:收集乳腺包裹性乳头状癌的石蜡组织样本进行HE染色,FISH及免疫组化染色,随访患者,对肿瘤进行分级。根据分级情况,利用统计学分析比较高级别与中低级别病例在临床特征、组织形态学、免疫组化及预后随访特征方面的差异。实验结果:(1)30例EPC患者中,25例为中低级别,5例为高级别,前者的中位年龄为60岁,后者为36岁。高级别患者明显较中低级别患者年轻。(2)组织结构比较显示,80%高级别EPC表现为典型的实性结构伴明显的淋巴细胞浸润,乳头分枝粗大,排列拥挤,轴心上衬附细胞排列拥挤,明显的复层结构且异型性显著。在周围伴浸润成分上,高级别EPC伴浸润成分的病例占80%,32%的中低级别EPC伴有浸润成分。(3)免疫组化染色显示,所有的高级别EPC均为三阴表型,而中低级别均激素受体表达阳性,48%的中低级别EPC为Her-2表达中阳性(2+),仅一例样本FISH检测呈Her-2基因扩增。(4)2例高级别EPC CK5/6阳性表达,5例高级别EPC EGFR阳性表达,基底样标记物的表达明显高于中低级别样本。同时高级别EPC细胞增殖指数Ki67表达也明显高于中低级别EPC,P<0.001。(5)高级别EPC可能具有更高的增殖能力和恶性转移潜能。高级别EPC应该及时处理,积极随访。实验结论:与中低级别EPC相比,高级别EPC常出现在年轻女性中,表现为实性组织结构,三阴基底样免疫表表型、常伴浸润癌成分。出现高级别EPC时,应该注意与实性乳头状癌相鉴别。高级别EPC可能具有更高的增殖能力和恶性转移潜能。高级别EPC应该及时处理,积极随访,以防其远处转移。今后的分子病理研究可以更全面的揭示该亚型的分子特征。第二部分:中低级别EPC分子病理特征及发病机制实验目的:探索中低级别EPC分子病理特征及发病机制,揭示EPC的突变特征和重要驱动通路,借此定义EPC特殊的临床病理特征。材料与方法:在第一部分25例中低级别EPC的基础上,将样本扩大至27例进行全外显子测序(Whole Exome Sequencing,WES),根据测序结果进行部分样本一代测序验证,针对测序结果进行突变负荷分析,突变频谱分析,突变特征分析,GO富集分析,突变克隆分析,最后针对得到的高频突变基因与TCGA数据库对比分析。在全外显子测序的基础上扩大样本至41对,设计目标区域测序panel测序(Targeted Regions Sequencing,TRS),针对重要位点进行一代测序验证,根据最终确定结果绘制高频突变基因图谱,突变基因通路富集,为了明确EPC的突变特征与多个乳腺癌数据队列对比分析。ZFPM1是EPC特征性的高频突变基因,与其他疾病差异比较。为了研究ZFPM1基因功能,设计ZFPM1免疫组化分析RT-PCR,qPCR检测蛋白与RNA表达水平,设计突变体质粒进行细胞转染,判断突变体对细胞功能的影响,主要实验包括免疫荧光,荧光素酶报告实验,细胞迁移实验,细胞增殖实验。实验结果(1)WES发现,27对EPC的主要突变频谱特征为C>T/G>A、T>C/A>G及C>A/G>T,利用TCGA数据库信息,将Luminal A浸润性乳腺癌的突变频谱与EPC做对比,发现两者的主要突变频谱几乎一致,与原位癌的突变频谱特征有所差别。从突变特征角度分析,EPC的3种突变特征有两种与浸润性乳腺癌的特征几乎一致,均与己知的 Signature 5 和 Signaturel3 类似。(2)此外WES提示,EPC的突变负荷较低,平均TMB为1.07/Mb(Range 0.1-8.16/Mb)。TCGA数据库中提取的245例Luminal A型浸润性乳腺癌的的突变信息分析发现发现这245例浸润癌的平均TMB为1.02/Mb(Range 0.07-6.67/Mb)。以上两种亚型的乳腺癌TMB无明显差异。(3)TRS发现,41对EPC中有9例ZFPM1突变,突变均可产生截断或延长蛋白且无热点,该基因是EPC特征性的高频突变,而其他类型的乳腺癌突变频率极低。(4)TRS发现,51%的样本存在IPI3K-AKT-mTOR通路基因突变。重要基因突变包括 PDC3CA(51%)、ZFPM1(21.9%)、GATA3(17%)、AKT1(14.6%)、CTCF(14.6%)、KMT2C(14.6%)、CBFB(4.8%)、ULK1(4.8%)。除此之外,EPC 出现了许多ER相关转录因子基因突变,如GATA3、ZFPM1、CTCF,KMT2C。(5)双荧光素酶报告实验显示,在乳腺癌细胞系中ZFPM1 C端锌指结构变异可以促进GATA3转录效应的提升。(6)TRS显示,与LuminalA浸润性乳腺癌相比,41对EPC均未检测到TP53通路基因的突变,这意味着大多数EPC保留了抑癌基因TP53、RB1的活性,EPC中检测到的DNA损伤应答基因突变仅10个,推测这可能是EPC预后较好的原因之。(7)统计学证明,ZFPM1突变与PI3K-AKT-mTOR通路突变共存具有相关性。经克隆分析发现二者的突变可能参与驱动部分中低级别EPC发生。实验结论(1)ZFPM1是EPC特征性的高频突变基因,与PI3K-AKT-mTOR通路可能共同参与驱动部分EPC。(2)ZFPM1其后锌指截断或延长突变可能诱导GATA3转录活性的升高。除了PI3K-AKT-mTOR通路的改变外,EPC中还涉及多种转录调控的基因突变,这些基因突变可能会影响ER转录调控进程。(3)EPC与Luminal A亚型浸润癌分子变异特征更为接近。EPC体细胞样本关键驱动基因突变较少、CGC-肿瘤一线基因突变较少、涉及DDR通路基因突变较少是EPC预后好的可能原因,这些因素都在一定程度上诠释了低中级别EPC良好的生物表型。