【摘 要】
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胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌与猪肺炎支原体临床症状相似,且常与其他呼吸道病原形成混合感染,临床鉴别诊断十分困难。建立一种能够快速、灵敏、高特异性且可量化的检测方法,对这三种呼吸道疾病的早期诊断、预防控制及净化具有重要意义。以NCBI中已有上述3种病原基因序列为参考,针对胸膜肺炎放线杆菌的ApxⅣ基因、副猪嗜血杆菌Omp2基因、猪肺炎支原体的P46基因分别设计三对特异性引物和三条TaqMan探针,
【基金项目】
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西北农林科技大学广西金陵研究院基金（编号:2019-001）；
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胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌与猪肺炎支原体临床症状相似,且常与其他呼吸道病原形成混合感染,临床鉴别诊断十分困难。建立一种能够快速、灵敏、高特异性且可量化的检测方法,对这三种呼吸道疾病的早期诊断、预防控制及净化具有重要意义。以NCBI中已有上述3种病原基因序列为参考,针对胸膜肺炎放线杆菌的ApxⅣ基因、副猪嗜血杆菌Omp2基因、猪肺炎支原体的P46基因分别设计三对特异性引物和三条TaqMan探针,建立能够同时检测三种病原的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行试验。并对临床样品进行了应用检测,同时与普通PCR方法进行了对比。获得如下结果:成功建立了胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体TaqMan多重实时荧光定量PCR检测方法,通过对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、巴氏杆菌等病原检测,不同病原之间无交叉反应,仅有胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体阳性模板有扩增信号。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,胸膜肺炎放线杆菌标准曲线相关系数为0.999;副猪嗜血杆菌标准曲线相关系数为0.998;猪肺炎支原体标准曲线相关系数为1.000。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法最低检测拷贝数胸膜肺炎放线杆菌为9.14×100copies/μL、副猪嗜血杆菌1.18×101copies/μL、猪肺炎支原体1.55×101copies/μL,检测下限比常规PCR高103倍;重复试验变异系数在2%以下,重复性良好。使用本方法检测了284份临床样本,TaqMan多重实时荧光定量PCR病原检出率20.42%,其中胸膜肺炎放线杆菌28例,副猪嗜血杆菌31例,猪肺炎支原体44例,两种或三种病原同时存在28例,常规PCR病原检出率4.58%。
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