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杯状细胞化生和黏液高分泌是哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性气道炎性疾病的标志性特征。正常的黏液分泌是防止病原微生物和毒素攻击的有效屏障，也是气道先天性免疫系统的重要组成部分。在慢性炎症等病理状态下，气道黏液大量分泌，导致反复呼吸道感染和气道阻塞。黏液高分泌引起的气道阻塞是慢性气道炎性疾病发生和发展的重要原因，在慢性气道炎性疾病进展的过程中，中性粒细胞弹性蛋白酶、活性氧簇和多种细胞因子会损伤气道，导致黏蛋白大量合成和分泌。迄今为止，已经发现有20种不同的黏蛋白（mucin, MUC）基因，其中，气道最主要的分泌型黏蛋白是MUC5AC，主要由杯状细胞分泌。现有研究发现MUC5AC上调表达和杯状细胞化生是气道黏液高分泌的主要特征性表现。支气管哮喘是慢性气道炎性疾病的代表，黏液高分泌是支气管哮喘重要的病理特征，气道黏液高分泌已经成为影响哮喘病情和预后的独立危险因素。在支气管哮喘患者中，活化的Th2细胞分泌的细胞因子，可以直接激活肥大细胞， Th2型细胞因子主要包括白介素13(Interleukin-13,IL-13)、IL-9、IL-5和IL-4，其中IL-13和支气管哮喘关系最为密切，也是目前研究最为深入的炎性因子。在支气管哮喘中，氧化和抗氧化的失衡是导致气道黏液高分泌的另一个重要原因。IL-13刺激后细胞内活性氧簇（reactive oxygenspecies, ROS）显著上升，ROS能够损伤细胞的大分子结构例如DNAs，类脂和蛋白质，从而导致氧化应激所诱导的组织损伤。氧化-抗氧化失衡可能是IL-13诱导黏液高分泌发生的重要机制，由于氧化应激在慢性气道炎性疾病的发生发展中居重要地位，因此抗氧化是治疗黏液高分泌的重要思路。目的：本研究在细胞模型中探讨IL-13对MUC5AC的转录和合成的影响，并探讨相关的信号转导机制。从抗氧化的思路出发，选择醛糖还原酶抑制剂作为干预因素，研究醛糖还原酶抑制剂对IL-13诱导的MUC5AC过度合成的影响及其分子机制。方法：在细胞模型中研究IL-13对MUC5AC转录和蛋白合成的影响：培养人气道上皮细胞株(Human bronchial epithelial16, HBE16)，在IL-13刺激前予以无血清培养液饥饿培养24小时。实验分为以下四组：对照组（加入PBS）、10nM IL-13组、25nM IL-13组、50nM IL-13组。通过四甲基偶氮唑盐光吸收法{3-(4,5-dimethiylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT法}检测IL-13刺激后细胞活性的变化；逆转录-聚合酶链反应（Retrovirus-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测IL-13刺激后MUC5AC mRNA表达的变化；酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测IL-13刺激后MUC5AC蛋白表达的变化。在细胞模型中研究IL-13刺激黏液高分泌的信号转导途径通过细胞模型研究IL-13刺激黏液高分泌的信号转导机制。培养人气道上皮细胞株HBE16细胞，在IL-13刺激前予以无血清培养液饥饿培养24小时。A771726用来特异性抑制信号转导与转录因子6(Signal Transducer and Activator of Transcription6, STAT6)的表达。通过RT-PCR检测STAT4, STAT6, p38和细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2） mRNA表达的变化，通过western blotting检测STAT6, p38和ERK1/2蛋白表达的变化。通过凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA）检测FOXA2（The forkhead box transcription factor A2,FOXA2)和激活蛋白1（Activation protein-1，AP-1）的DNA结合活性的变化。通过细胞免疫化学、激光共聚焦技术检测IL-13刺激后跨膜蛋白16A（transmembrane protein16A, TMEM16A）和富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物(Myristoylated Alaninerich C Kinase Substrate,MARCKS)蛋白表达的变化。抑制醛糖还原酶(Aldose reductase, AR）对IL-13诱导的黏液分泌的作用及其分子机制研究：通过MTT方法检测zopolrestat对HBE16细胞活力的影响。合成以往实验验证有效的醛糖还原酶siRNA干扰序列。HBE16细胞饥饿培养24小时后，加入zopolrestat或者AR siRNA，然后加入IL-13刺激24小时。通过RT-PCR或者ELISA检测MUC5AC的转录和蛋白合成的变化。通过荧光探针检测细胞内ROS生成的变化。通过westernblotting方法检测AR、p-STAT6和激酶2（Janus Kinase2, JAK2）蛋白表达的变化。结果：IL-13对MUC5AC转录和蛋白合成的影响：IL-13能够减弱HBE16细胞的活力，对HBE16细胞活力的影响呈剂量依赖性。同对照组相比IL-13刺激后MUC5AC基因转录和蛋白表达显著增强，差异有统计学意义，其效应呈剂量相关性（均P<0.05）。IL-13刺激黏液高分泌的信号转导机制通过RT-PCR和western blotting检测IL-13刺激后细胞内信号转导分子转录和蛋白表达的变化。和对照组相比，p-STAT6的表达显著增高(P<0.05)，而p-ERK1/2的表达没有显著变化(P>0.05)。在加入STAT6特异性抑制剂A771726后，IL-13诱导的MUC5AC基因转录和蛋白合成显著降低(P<0.05)。IL-13刺激后24-48小时能够检测到p38蛋白合成增加。IL-13刺激后FOXA2的DNA结合活性显著降低，而AP-1的DNA结合活性没有显著变化(P>0.05)。IL-13能够显著刺激细胞内ROS合成增加(P>0.05)，在48小时仍能持续刺激ROS生成。通过免疫荧光检测IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS蛋白表达的变化，IL-13能够显著增加TMEM16A和MARCKS的蛋白表达(P<0.05)。醛糖还原酶抑制剂干预IL-13诱导的黏液分泌及其分子机制研究：Zopolrestat或者醛糖还原酶-小分子干扰RNA （AldoseReductase-Short interfering RNA，AR-siRNA)能够显著抑制IL-13诱导的MUC5AC的转录和蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05)。zopolrestat或者AR-siRNA能够显著减少IL-13诱导的ROS生成(P<0.05)、抑制p-JAK2和p-STAT6的表达(P<0.05)，从而减少黏液产物的生成。结论：1、IL-13能够在细胞模型中显著刺激MUC5AC的转录和蛋白合成，IL-13刺激黏液分泌的效应呈剂量相关性，随着剂量增加，细胞活力也相应减弱。2、IL-13刺激后STAT6的转录和蛋白合成显著增强，而ERK1/2的表达没有显著变化。IL-13刺激后FOXA2的DNA结合活性显著降低，提示IL-13可能通过JAK2/STAT6-FOXA2通路刺激黏蛋白合成增加。3、IL-13能够通过P38/MAPK信号通路刺激黏蛋白合成增加，p38/MAPK信号通路需要依赖STAT6信号通路的激活。4、IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS表达显著增加，IL-13可能通过TMEM16A和MARCKS调控黏蛋白的分泌。5、IL-13刺激后细胞内ROS生成显著增加，氧化应激可能是IL-13引起黏液分泌的重要机制，抑制醛糖还原酶能够减少IL-13诱导的ROS生成。6、醛糖还原酶在慢性气道炎性疾病黏液高分泌的发生中居重要地位，抑制醛糖还原酶能够减少细胞内ROS生成，抑制JAK/STAT信号通路，从而减少IL-13诱导的黏蛋白合成。