htpB基因在水产致病菌变形假单胞菌感染过程中的功能研究

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大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国单一品种养殖量最大的海水鱼类之一。近年来,大黄鱼养殖业的健康发展受到了病害的严重制约。“内脏白点病”是网箱养殖大黄鱼最常见的病害之一,对大黄鱼集约化养殖的危害极其严重,已造成巨大经济损失。目前,变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼“内脏白点病”的病原菌的观点得到广泛认可。变形假单胞菌不但可以感染大黄鱼,还可以感染其他多种水产养殖经济动物,且已造成不同程度的经济损失。已有报道和本实验室前期研究显示,大黄鱼“内脏白点病”具有明显的水温依赖性。本实验室前期通过生物信息学和转录组高通量测序技术,首先对在12°C、18°C和28℃下分别培养的变形假单胞菌的基因表达模式进行比较,发现htpB基因在致病温度(18°C)培养条件下的表达水平显著高于非致病温度(12°C和28°C)培养条件下的表达水平,这意味着htpB基因可能与变形假单胞菌的致病性相关联,htpB受温度变化的调控可能是变形假单胞菌仅在特定温度下致病的重要诱因。因此,本文拟以本实验室从患病大黄鱼上分离得到的变形假单胞菌NZBD9菌株为研究对象,对htpB基因在变形假单胞菌感染过程中的功能及其调控机制进行初步的研究,主要研究内容如下:(1)采用RNAi技术,成功构建5株htpB稳定沉默菌株。通过qRT-PCR检测沉默菌株中htpB的表达情况,挑选出htpB沉默效果最好的一株菌株,用于进行后续实验。(2)对变形假单胞菌htpB-RNAi沉默菌株的毒力进行检测,相比变形假单胞菌野生型菌株,沉默株的致死时间有所延迟,致死率和体内分布情况有明显下降。这说明htpB沉默后,在一定程度上降低了变形假单胞菌的毒力。(3)攻毒实验显示,脾脏是变形假单胞菌在鱼体内最主要的病灶。通过qRT-PCR检测变形假单胞菌htpB随时间变化的表达情况,我们发现在野生株感染斜带石斑鱼2d的样本中htpB表达水平最高。所以,我们选取健康的和分别感染变形假单胞菌野生株、htpB-RNAi沉默株后达到2d的斜带石斑鱼的脾脏进行病原-宿主互作转录组测序分析。通过测序我们发现,htpB沉默后,变形假单胞菌的其他毒力基因表达水平有不同程度的下降,其中包括flgD、flgE、fliG、rpsE、rpsS等与鞭毛运动性、生物成膜和细菌核糖体形成等生命活动密切相关的功能基因,表明htpB在变形假单胞菌感染致病过程中可能通过调控其他毒力基因的表达起到关键调控作用。相比野生株感染后的脾脏样本,htpB-RNAi菌株感染后的脾脏样本中宿主基因表达模式也有很大变化,从中我们可以分析推测出依赖于htpB的变形假单胞菌致病机制,依赖于htpB的宿主对变形假单胞菌的防御机制,以及不依赖于htpB的宿主对变形假单胞菌的防御机制。通过构建病原-宿主互作网络图可以发现:首先,感染的发生可以促进宿主免疫相关基因的表达,同时抑制病原毒力基因的表达。其次,病原基因与宿主基因之间存在着相互的影响,其中,IL6在病原与宿主相互作用中起着关键枢纽作用。最后,宿主基因之间存在着相互的调控关系,其中,来源于宿主的IL6、IL1R2、IL1B和TLR5等四个基因在宿主互作网络中执行关键调控作用,而htpB的表达对IL6和IL1R2的表达有促进作用,因此IL6和IL1R2可能是经由htpB调控的变形假单胞菌致病机制的关键,也可能是经由htpB调控的变形假单胞菌与宿主免疫系统发生相互作用的关键。(4)利用GeneMANIA,我们可以发现,flgC和rpsE可能在htpB介导的变形假单胞菌毒力调控过程中起着更为重要的作用,这与我们的毒力表型验证实验结果一致,htpB沉默株的运动性和细菌成膜能力均有显著下降。同时,分析结果显示,IL1R2可能在宿主对变形假单胞菌的防御过程中起着更为重要的作用。进一步的研究将有助于验证这一假设。(5)本研究结合生物信息学分析、微生物学和分子生物学实验技术,对htpB基因在变形假单胞菌感染过程中的功能及其调控机制进行初步研究的同时,对应用病原-宿主相互作用转录组进行重要水产病原微生物致病机制探索的可行性进行了初步的验证,结果显示,本技术具有较高的准确性和启发性,可能为水产疾病研究提供新的思路和强有力的工具。
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