背景和意义 脑中缓慢进展的炎症反应可能在包括帕金森病、阿尔采默病在内的许多神经变性疾病的病理进程中扮演深层角色。小胶质细胞作为脑中最重要的免疫反应活性细胞，在这一病理过程中居于核心地位。小胶质细胞的激活不仅仅是简单地对死亡细胞的残骸进行清除，而是活跃地参与着神经元损伤的启动和放大过程。激活的小胶质细胞所产生的过量的一大类因子，包括一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)等被认为对神经元死亡具有重要作用。这些前炎症细胞因子或活性氧化分子所形成的瀑布效应形成恶性循环，最后导致神经元的损伤或死亡。近年的研究表明，小胶质细胞的激活在帕金森病的病理发生中具有极为关键的作用。基于上述发现，以抑制小胶质细胞的激活过程为靶点设计全新的治疗策略，以延缓神经变性疾病的进程已成为研究热点。小胶质细胞激活机制的阐明、相关药物筛选体系的建立在相当程度上依赖于获得大量的小胶质细胞和与之相匹配的效应细胞模型。同时，一种绿茶多酚的主要单体成份表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的良好的外周抗氧化损伤和抗炎作用在近年备受关注，初步的研究表明EGCG具有强大的神经保护作用。但EGCG是否具有抑制CNS第四军医大学博士学位论文中小胶质细胞的激活作用?如果有，通过何种机制?这些问题亚待阐明。课题目的1.建立小胶质细胞激活介导神经元损伤实验体系和药物筛选体系。2.检验该体系的可行性和可信性。3.在体研究EGCG对小胶质细胞激活的抑制作用。4.体外深入研究EGCG对小胶质细胞激活的抑制作用及其机制。采用方法1.在原代中脑腹侧多巴胺能神经元培养培养体系上，利用1一甲基·4-苯基毗咤(MPP+)造成选择性多巴胺能神经元损伤细胞模型，给予不同剂量EGCG，免疫细胞化学染色方法标记酪氨酸经化酶(TH)观察不同剂量EGCG对阳性细胞数目的影响。2.通过体视学方法观察不同剂量EGCG对l一甲基一4一苯基一1，2，3，6-四轻毗陡(MPTP)所致c57Bu6小鼠选择性多巴胺能神经元损伤这一经典动物模型中脑TH阳性细胞数目的影响，同时利用小胶质细胞膜抗原CDllb标记小胶质细胞，观察EGCG对小胶质细胞激活的作用。3.通过两种不同的方法—选择性贴附振摇分离法和温和消化法获取纯化的小胶质细胞，利用Dil一ac一LDL标一记技术、Greiss反应和ELISA方法，比较这两种方法的得率、所获小胶质细胞的纯度、形态和生物学特性如释放NO和TNF一a这两种重要的与炎症反应有关的细胞因子的能力。4.全反式维甲酸诱导人神经母细胞瘤株SH一SYSY细胞分化为具有多巴胺能神经元特性的细胞。利用该细胞模型，采用MTT方法和3H标记多巴胺摄取作用，观察细菌脂多糖(LPS)激活小胶质细胞条件培养液对SH一SYSY的损伤作用。5.在高度纯化的小胶质细胞培养体系中，利用Dil一ac一LDL原位标记技术，观察EGCG对小胶质细胞激活所致的形态学改变、NO和INF一。释放的抑制作用。 5第四军医大学博士学位论文6.更进一步，用免疫印记方法(Westem blotting)和反转录聚合酶链反应(R不PCR)研究EGCG对NO和TNF一释放的抑制作用是否通过下调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和1刊F一。mRNA而实现。7.结合温和消化法分离小胶质细胞技术和SH一SYSY诱导分化细胞模型，通过系列浓度LPS的刺激和所产条件培养液对SH一SYSY的损伤作用，检验该系统的可行性。8.最后，利用原代中脑腹侧多巴胺能神经元培养培养体系和分化的SH一SYSY细胞模型，验证EGCG对小胶质细胞的抑制作用是否具有神经保护作用。主要结果l，在MPP+诱导的原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元损伤模型中，预先给予EGCGI协M一100pM可显著减轻MPP+诱导的多巴胺能神经元减少，保护率为22.2%一80.5%。在体情况下，lmg瓜g剂量EGCG腹腔注射对MPTP模型小鼠Ag区TH免疫阳性细胞丢失的保护率为71.7%，对中脑区域总TH免疫阳性细胞数丢失的保护率为50.9%，smg瓜g和loms/kg剂量组中脑各区域TH阳性神经元数量均较模型组高(p<0.05)。2.在体情况下，与EGCG的多巴胺能神经元保护作用相一致， MPTP导致中脑部位CDllb免疫阳性染色细胞增多、深染，EGCG处理组中脑部位CDllb免疫阳性染色细胞少而浅淡，表明EGCG对小胶质细胞的的激活具有抑制效应。3.利用温和消化法可获得高纯度(99.9%)的小胶质细胞，所获细胞在形态上与经典的振摇法获得的小胶质细胞相同，在功能上同样具有对LPS刺激产生相同反应的能力。4、在野生SH一SYSY细胞培养液中，10“M的全反式维甲酸可成功诱导出具有多巴胺能神经元特性的细胞，如细胞变细小，伸出突起，细胞间连接成网络，并具有多巴胺摄取作用。LPS激活的小胶质细胞条件培养液对分化的SH一SYSY细胞和其3H一多巴胺摄取能力具有明显的剂量依赖的损伤作用。第四军医大学博士学位论文5.终浓度为SO0ng/ml的LPS处理可诱导小胶质细胞出现明显的形态学改变，同时伴随着条件培养液中一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子。(TNF一Q)的明显升高。在LPS诱导前给予不同剂量的EGCG可明显减少LPS所诱导的小?