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药物抵抗是当前包括人非小细胞肺癌（NSCLC）在内恶性肿瘤临床干预领域的重大科技问题。研究显示微小RNA-7（miR-7）在非小细胞肺癌（NSCLC）发生中具有重要调控作用,是NSCLC的基因治疗潜在新靶点之一。然而,NSCLC是否存在对miR-7干预的抵抗现象仍未有研究报道。本研究中,我们拟观察人NSCLC细胞对miR-7干预的潜在抵抗现象,并探讨其相关分子机制。本课题研究内容包括三部分,分述如下:目的:第一部分观察人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞抵抗miR-7的现象并分析相关基因表达特征。第二部分研究miR-7抵抗的人NSCLC细胞在体内、外生长和转移变化。第三部分探讨人NSCLC细胞抵抗miR-7的分子机制。方法:第一部分:1.分别将人NSCLC细胞95D和A549以8x10~4个/孔铺于24孔板中,24h后利用Lip-3000将2.5ug pc DNA3.1-miR-7（p-miR-7）或pc DNA3.1真核表达载体（p-Cont）体外瞬时转染细胞,共转染三次,每次间隔48h;利用CCK8实验和细胞计数法检测细胞生长情况;Real-time PCR探针法检测细胞的miR-7表达情况;2.利用Lip-3000分别将2.5ug p-miR-7或p-Cont载体体外瞬时转染人NSCLC 95D和A549细胞;转染48h后,利用800ug/ml的G418筛选细胞,持续筛选14天后,获得阳性克隆细胞（分别命名为:A549/miR-7,A549/Cont和95D/miR-7,95D/Cont细胞）,并扩增传代;利用Real-time PCR探针法检测各组细胞中miR-7表达水平;并用鬼笔环肽（phalloidin）染色观察细胞形态变化;利用Lip-3000分别将2nmol miR-7 mimics和miR-30b-5p mimics体外瞬时转染上述细胞;48h后利用CCK8法检测细胞生长情况;3.利用RNA-seq技术检测上述稳定转染细胞的全基因表达情况;生物信息学分析相关信号通路传导差异。第二部分:1.利用CCK8法检测上述各组细胞增殖情况;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞周期的变化;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Real-time PCR抵抗细胞中细胞周期蛋白CDK1、CDK2、CDK4、CDK6的表达,转移相关蛋白MMP2、MMP9、E-Cadherin、N-Cadherin的表达;Western Blot检测PI3K/AKT、MAPK信号通路相关分子PDK1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、Ras以及转移相关分子Vimentin、E-cadherin、N-cadherin的表达;2.分别利用上述各组细胞以1x10~7个/只右腋下荷瘤Balb/c裸鼠;荷瘤第7天后,每隔两天动态记录肿瘤生长情况,于第14天处死模型小鼠并取出肿瘤和肺脏,记录肿瘤和肺脏的相关体积重量指数;荧光原位杂交法（Fluorescence in situ hybridization,FISH）分析裸鼠肿瘤组织中miR-7的表达情况;利用H＆E染色观察小鼠肿瘤与肺脏病理学变化;Real-time PCR检测抵抗细胞肿瘤组织中细胞周期蛋白CDK1、CDK2、CDK4、CDK6的表达,转移相关蛋白MMP2、MMP9、E-Cadherin、N-Cadherin的表达;Western Blot检测PI3K/AKT、MAPK信号通路相关分子PDK1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、Ras以及转移相关分子Vimentin、E-cadherin、N-cadherin的表达。第三部分:1.利用RNA-seq及Target Scan、miRBase等靶分子生物信息学预测软件筛选miR-7抵抗的潜在靶分子;进一步利用Real-time PCR,Western blot及IF技术检测候选靶分子的表达水平;将人NSCLC 95D和A549细胞以8x10~4个/孔铺于24孔板中,24h后将p-miR-7及p-Cont载体以2.5ug/孔转染NSCLC细胞,共转染三次,每次间隔48h,每次转染48h后利用Real-time PCR检测PAX6的表达;2.利用RNAi干扰技术,合成PAX6 RNAi干扰序列体外瞬时转染入抵抗miR-7的A549细胞中;48h后利用Real-Time PCR、及IF检测PAX6的表达;CCK8技术检测转染后48h细胞的增殖情况;划痕法检测细胞迁移能力;WB检测周期相关蛋白CDK1、CDK4、CDK6以及相关信号分子PDK1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK的表达;利用A549/miR-7细胞1x10~7个/只右腋下荷瘤裸鼠,每隔两天动态记录肿瘤生长情况,6天后将模型随机分为两个组,分别以75ug/只注射NC-RNAi、PAX6-RNAi。每隔三天记录肿瘤生长情况,于第15天处死小鼠取出肿瘤与肺脏,并记录二者体积重量指数。利用H＆E染色观察小鼠肿瘤与肺脏病理学变化;IF观察小鼠肿瘤组织中PAX6及Ki-67的表达。结果:第一部分:1.Real-time PCR结果显示:与p-Cont转染组相比,p-miR-7转染组人NSCLC A549和95D细胞的miR-7表达均明显上调（P＜0.05）;CCK8法和细胞计数结果显示:与p-Cont转染组相比,p-miR-7转染组细胞生长明显减少,抑制率约70%（P＜0.05）,这与我们前期实验一致;重要的是,随着转染次数的增加,p-miR-7转染组细胞内miR-7表达水平进一步增加（P＜0.05）,然而细胞生长抑制率逐渐降低至不足20%,存活细胞不断增多（P＜0.05）,提示人NSCLC细胞对miR-7抵抗的可诱导性;2.利用G418分别成功筛选出稳定转染p-Cont或p-miR-7的人NSCLC A549和95D细胞（分别命名为A549/miR-7、A549/Cont和95D/miR-7、95D/Cont）;phalloidin染色显示:与对照A549/Cont或95D/Cont细胞相比,A549/miR-7和95D/miR-7细胞形态均显示出上皮间质转化（EMT）特征,结构松散,细胞间连接减少;Real-time PCR结果显示:与对照A549/Cont或95D/Cont细胞相比,A549/miR-7和95D/miR-7细胞内miR-7均高表达（P＜0.05）;重要的是,CCK8结果显示:分别与对应的对照mimics组相比,miR-30b-5p mimics转染组A549/miR-7细胞生长明显抑制（P＜0.05）,然而,miR-7 mimics转染组A549/miR-7细胞生长并无差异（P＞0.05）,提示人NSCLC对于miR-7抵抗的特异性;3.RNA测序结果显示:与人NSCLC 95D/Cont细胞相比,95D/miR-7细胞细胞共有259个基因上调,251个基因下调。基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）结果表明:两组细胞与凋亡相关的基因变化无明显差异;但与95D/Cont细胞相比,95D/miR-7细胞中与细胞干性、生长、转移相关基因变化较为显著;此外,GO和KEGG分析结果显示:95D/miR-7细胞中MAP激酶相关基因,以及Wnt、Ras、PI3K/AKT等信号通路的相关基因均明显上调。第二部分:1.克隆形成结果显示:与对照A549/Cont或95D/Cont细胞相比,A549/miR-7和95D/miR-7细胞集落形成能力明显增强;FCM结果显示:A549/miR-7和95D/miR-7细胞G0/G1期比例下调（P＜0.05）,S期比例上调（P＜0.05）,G2/M期比例下调（P＜0.05）;免疫荧光结果显示:A549/miR-7和95D/miR-7细胞中Ki-67表达显著上调（P＜0.05）;Transwell结果显示:A549/miR-7和95D/miR-7细胞的迁移和侵袭能力明显增强（P＜0.05）;WB结果显示:与对照A549/Cont或95D/Cont细胞相比,A549/miR-7和95D/miR-7中MAPK、PI3K/AKT信号通路相关分子Ras,ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,PI3K,p-PI3K,PDK1,转移相关分子N-cadherin,E-cadherin,Vimentin表达明显上调（P＜0.05）;2.结果显示:与A549/Cont对照组肿瘤组织相比,A549/miR-7组肿瘤体积明显增大,肿瘤重量增加（P＜0.05）;肿瘤H＆E染色结果显示:与A549/Cont组相比,A549/miR-7组肿瘤组织较为紧密,肿瘤细胞浸润较多（P＜0.05）。FISH结果显示:A549/miR-7组肿瘤组织中miR-7表达显著上调;肺脏H＆E染色结果显示:与A549/Cont组相比,A549/miR-7组的肺脏组织肿瘤转移灶明显,肿瘤细胞肺转移指数增加（P＜0.01）。第三部分:1.RNA-seq结果显示:与A549/Cont细胞相比,A549/miR-7细胞中多个靶分子表达均上调,其中PAX6的水平以上调1.8倍居于最高;WB结果进一步显示:A549/miR-7细胞中PAX6表达显著上调;A549/miR-7与95D/miR-7细胞中上调1.5倍以上的基因、miRBase和Targetscan数据库获得的靶基因以及相关文献中显示的基因通过Venny分析,结果显示:在A549/miR-7与95D/miR-7细胞中,有37个共同的miR-7靶分子表达上调,PAX6在两株细胞中均明显高表达;Real-time PCR结果显示:抵抗miR-7的95D细胞中PAX6的m RNA水平明显增高（P＜0.05）;WB结果显示:与95D/Cont细胞相比,95D/miR-7细胞中PAX6表达水平显著上调;IF显示与A549/Cont或95D/Cont细胞相比,PAX6在A549/miR-7及95D/miR-7细胞中均高表达（P＜0.05）,在体内A549/miR-7肿瘤组织中显著高表达（P＜0.05）;重要的是,Real-time PCR结果显示,在三次转染过程中,PAX6的表达呈现先降低后增高的趋势（P＜0.01）;2.CCK8实验结果显示:与NC-RNA对照组相比,PAX6-RNAi实验组A549/miR-7细胞生长减慢;划痕实验结果显示:PAX6-RNAi实验组A549/miR-7细胞转移能力削弱（P＜0.01）;WB结果进一步表明:PAX6-RNAi实验组A549/miR-7细胞PAX6表达、MAPK,PI3K-AKT相关信号分子ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,PDK1表达均明显下调,生长相关蛋白CDK1,CDK4,CDK6表达下调（P＜0.05）;荧光结果提示PAX6-RNAi实验组A549/miR-7细胞PAX6与Ki-67表达显著下调（P＜0.05）;WB结果显示:在PAX6-RNAi实验组A549/miR-7细胞中,与PAX6相关的信号途径表达也明显下调（P＜0.05）;3.动态观察体内转染PAX6-RNAi后A549/miR-7细胞裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长,记录并绘制肿瘤生长曲线。结果显示:与NC-RNAi对照组相比,PAX6-RNAi实验组A549/miR-7移植瘤模型肿瘤生长较慢（P＜0.01）。且PAX6-RNAi实验组A549/miR-7肿瘤体积较小、体重较轻（P＜0.01）;H＆E染色结果表明:PAX6-RNAi实验组A549/miR-7移植瘤模型肿瘤细胞疏松,且肺组织中转移的肿瘤细胞浸润较多（P＜0.05）;免疫荧光结果提示:PAX6-RNAi实验组A549/miR-7移植瘤模型肿瘤组织中PAX6的表达显著下调（P＜0.05）;WB结果进一步提示:PAX6-RNAi实验组A549/miR-7移植瘤模型肿瘤组织中PAX6表达显著下调,与生长、转移相关蛋白CDK1,Cyclin D1,Vimentin,N-cadherin,E-cadherin表达明显下调,MAPK、PI3K/AKT相关信号分子ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,PDK1,PI3K表达显著下调（P＜0.05）。结论:1.人NSCLC细胞存在miR-7干预抵抗,该现象具有可诱导性和特异性。2.抵抗miR-7的NSCLC细胞在体外、体内均显示出更强的生长及转移能力,机制与PAX6上调表达和PI3K、MAPK等信号通路传递改变有关。