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电化学生物传感器是一种集成设备,通过转换器将分析物与生物识别元素的相互作用转换为可识别易处理的电信号,为分析物提供定量分析信息。电化学传感策略因具有快速、敏感、易微型化和低成本等优势,从而在临床诊断,疾病监测,药物分析和环境监控等方面得到了广泛的发展和应用。近年来,各种各样的具有可编程性,高稳定性和高灵活性的DNA功能结构被开发出来,利用了 DNA功能结构的电化学生物传感器的特异性和灵敏度进一步提升。为了构建高特异性,低背景信号和高灵敏度的电化学传感平台,本论文通过利用环介导等温扩增H+,DNA功能结构和多种核酸放大技术,发展了三种用于不同类型生物分子检测的电化学传感器。1.LAMP-H+响应的低背景电化学比率传感器研究短链DNA环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）技术,因为其扩增出的多种产物限制了其在传感策略中的广泛应用,本实验巧妙地利用了Au@Fe3O4磁性纳米材料,对复杂的LAMP反应体系进行高效分离,将其副产物LAMP-H+作为信号转换器,发展了一种的和高灵敏和低背景的比率型电化学生物传感器用于检测短链DNA。将特异性序列短链生物标志物DNA（hDNA,21-nt）作为靶向外引物,实现环介导的等温扩增从而释放氢离子（LAMP-H+）,pH依赖型i-motif链（I*）和底物链（S*）的双链复合物通过Au-N结合在Au@Fe3O4上,在引入LAMP-H+后,导致I*折叠成i-motif构象从而与S*去杂交。S*进一步与催化链（C*）杂交形成Mg2+-DNAzymes,在Mg2+的作用下,其中编码了 F*的S*被剪切,从而释放出C*用于的重复形成和剪切Mg2+-DNAzymes。将含有F*的溶液引入到修饰的电极表面上引导两种信号探针发生链置换反应。通过F*介导的循环扩增反应,两种电流信号呈现相反的变化,电化学电流变化的比率对hDNA呈线性变化且具有高灵敏响应,检测限为:2.1 fmol·L-1。该策略通过结合LAMP-H+激发的i-motif开关构象转换和Mg2+-DNAzyme形成和剪切,LAMP-H+（i-motif/Mg2+-DNAzyme）F*逻辑转换有效地减小了传统基于LAMP的实验的固有背景。因此,我们的比率型策略将适用于各种短链DNAs甚至RNAs作为LAMP的靶向引物。2.邻位触及诱导催化发夹反应组装树枝DNA协同放大电化学生物传感的研究基于蛋白质的适配体、生物模拟酶和DNA树枝状分子,我们发展了一种通过邻位触及反应催化发夹组装（PLCHA）来指导功能DNA树枝大分子（DNADS）的构建,从而显著促进协同放大器:Pt纳米粒子（PtNPs）和四（N-甲基-吡啶-2-基）卟啉锰（Ⅲ）（MnTMPyP）的锚定和捕获的电化学适体传感器。在本实验中,凝血酶（TB）作为分析物,通过与编码在两个亲和探针（A1和A2）上的特异性适配体发生邻位结合,定向输出燃料链（F*）,并激活两个DNA发夹（H1和H2）进行PLCHA反应。在形成的双链未配对的位点上,两条功能化的单链（S1@PtNPs和S2@PtNPs）依次杂交,通过“自下而上”自组装形成DNADS,模拟过氧化物酶MnTMPyP嵌入到其双链支架上。用过氧化氢（H2O2）处理后,PtNPs和MnTMPyP协同催化氧化4-氯-1-萘酚（4-CN）能力极大提升,产生显著提高的定量分析TB的电化学信号,线性范围为1fmol·L-1-100 nmol·L-1,检测下限为10.7 amol·L-1。基于PLCHA定向的DNADS进行信号放大,这一检测路径可为监测各种疾病相关的蛋白质、酶或小分子开辟新的途径。3.Y-DNA结构双链置换放大的电化学生物传感器双目标物研究基于Y-DNA纳米结构的多功能化位点和链置换反应（strand displacement reaction,SDR）,本实验设计了一种对同一病毒（SARS-CoV-2）的两个基因片段进行同时检测。将高特异性和稳定性的Y-DNA同时作为支架和捕获探针修饰在电极表面上,对双目标物进行一步响应,实现了双目标物超快速灵敏检测。以SARS-CoV-2的两个基因片段:RdRp-COVID和ORF1ab-COVID（T1和T2）为目标物,三条单链（Y1,Y2和Y3）组装成Y-DNA,然后四条单链（S1,S2,S3和S4）与分别杂交,形成Y-DNA支架,孵育在电极表面,然后同时引入T1和T2时,分别Y-DNA上的两个分支上反应,释放出两条单链（S1和S3）,同时将Y-DNA上能与信号探针杂交的区域暴露,形成Y-DNA捕获探针,捕获两种不同的信号探针（SP1和SP2）,释放出T1和T2实现多次循环的SDR,电极表面上两种电化学信号显著增强,构建快速二联DNA电化学生物传感器。利用Y-DNA的多功能位点和高稳定性,便于同时准确识别两个目标,降低对同一疾病检测的假阴性信号。我们的双目标电化学生物传感器对选定的T1和T2具有高灵敏度,检测限低至6.85 fmol·L-1和4.79 fmol·L-1,并能精确检测多基因混合物中的特定目标,为其他疾病的双目标物的检测提高了可行的方法。