铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要障碍因子。全球大约有40亿hm2酸性土壤,主要分布在热带、亚热带及温带地区,尤其是发展中国家。我国酸性土壤遍及南方15个省区,总面积为2030万hm2。同时由于大量施用化学肥料,以及降酸雨等对土壤酸化的影响,Al的危害面积有增加的趋势。水稻是全球主要的粮食作物。水稻Al毒害主要发生在新开垦的旱地酸性土壤上,限制水稻矿质元素吸收和生长。硝态氮和铵态氮是水稻主要利用的两种矿质态氮,水稻对氮素的吸收和利用对水稻的生长起着重要作用。植物根尖质膜H+-ATPase活性与根系氮素吸收有关,并且质膜H+-ATPase活性受14-3-3蛋白的调控,水稻氮素吸收随H+-ATPase活性变化而发生变化,但关于水稻耐Al性与N吸收的关系的研究较少。因此,开展水稻铝胁迫对氮素营养吸收的研究具有理论和实践意义。本文从目前主要种植的10个水稻品种筛选出耐铝性差异明显的铝耐受型水稻滇优35号和铝敏感型水稻峰1A两个水稻品种为实验材料,在生理和分子水平上分析考察铝胁迫下水稻根尖14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase表达与互作响应水稻NH4+-N和NO3--N氮素吸收机理。主要获得了以下结果:1、在水培条件下进行10个水稻品种在不同铝浓度(0,20,50,100,200,400 mol·L-1)条件下根的相对伸长率、铬天青染色、抗氧化酶活性(超氧化岐化酶SOD,过氧化物酶POD,过氧化氢酶CAT)以及根中H2O2和MDA含量的测定,筛选铝胁迫最佳处理浓度和鉴定水稻铝耐性。研究结果表明,在50 μmol·L-1 Al浓度处理24小时条件下,峰1A的根具有较低的相对伸长率(55%),而滇优35号根的相对伸长率达到75%;铬天青染色实验结果表明随着铝处理浓度的增加,峰1A和滇优35号两种水稻根的着色程度越深,但峰1A着色程度更甚,铝胁迫下峰1A根尖铝含量高于滇优35号。滇优35号根中的MDA、H2O2含量上升幅度低于峰1A,峰1A根中膜脂过氧化程度大于滇优35号。铝胁迫下滇优35号根中的抗氧化酶SOD,POD,CAT活性明显高于峰1A,表明滇优35号的抗铝胁迫氧化能力强,抗氧化酶系统在滇优35号抗铝机制中发挥着作用。这些结果表明滇优35号为铝耐受型水稻,为峰1A为铝敏感型水稻。2、硝态氮(NO3--N)和铵态氮(NH4+-N)是植物根系直接吸收利用的最主要两种氮素形态。在铝胁迫下,分析以NOO3--N或NH4+-N不同氮源培养的水稻对铝的感应程度和氮素的吸收情况,并从质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的互作水平对氮素吸收的影响阐明水稻吸收氮素机理。结果表明,不同氮素作氮源,相对于滇优35号,在铝胁迫处理的峰1A根系质膜因过氧化而造成质膜损伤更严重,质膜H+-ATPase活性及其与14-3-3蛋白互作程度都小;相同条件处理,不同氮源培养水稻的质膜H+-ATPase的磷酸化以及14-3-3蛋白与磷酸化质膜 H+-ATPase 的互作水平为 NH4+-N/NO3--N(1:1)>NH4+-N>N03--N,水稻氮素吸收与质膜H+-ATPase的磷酸化变化趋势一致,氮源相同时,峰1A根尖质膜H+-ATPase的磷酸化以及14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的互作水平弱于滇35号,吸收的氮量少于滇35号。表明质膜H+-ATPase的磷酸化以及14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的互作水平参与水稻氮吸收过程的调控。3、为了进一步验证水稻的14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的表达与互作在调控水稻吸收氮素和植物耐铝能力中的作用,以峰1A和滇优35号2个水稻品种为试验材料,研究外源AsA对铝胁迫下水稻生长的生理响应的影响,阐明外源AsA缓解Al3+胁迫对水稻生长的生理生化影响机制。结果表明,外源AsA能进一步提高2种水稻根系中SOD、POD、CAT及APX等抗氧化酶活性,降低了水稻根系铝含量,能更有效清除由于铝胁迫诱导水稻根中H202的积累,降低膜脂的过氧化程度。与此同时,AsA可能通过增强水稻根中质膜H+-ATPase及与14-3-3蛋白的相互作用来提高质膜H+-ATPase的活性和泵H+能力,为硝态氮的吸收提供H+和能量,进而提高水稻对硝态氮的吸收能力。4、FC(壳梭孢素)通过促进14-3-3蛋白与磷酸化的质膜H+-ATPase结合而增加质膜H+-ATPase的活性;而AMP是14-3-3蛋白和磷酸化质膜H+-ATPase结合的抑制剂,具有抑制质膜H+-ATPase活性的作用。通过添加FC、AMP处理滇优35号来改变14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的相互作用,验证铝胁迫下二者的相互作用是否参与水稻氮素吸收及铝耐受性的调控作用。免疫共沉淀分析显示铝胁迫下FC的存在增强了水稻根中14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,根尖质膜H+-ATPase活性提高约1倍,根氢泵活性和质子外排能力显著增强,并提高了水稻对氮素的吸收量。而AMP的存在降低了水稻根中14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的相互作用,使根尖质膜H+-ATPase活性降低约0.67倍,根氢泵活性和排氢能力显著降低,降低了水稻对氮素的吸收量。这些结果进一步证实14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的互作水平参与铝胁迫下水稻氮素吸收的调控。综上所述,在铝胁迫下,水稻通过降低14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase的互作水平来减弱质膜H+-ATPase的活性和氢泵活性,减少对氮素的吸收;添加外源抗坏血酸AsA和质膜H+-ATPase特异激活剂FC都能降低铝毒的氧化伤害,增强了 14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase的互作水平,提高质膜H+-ATPase的活性和氢泵活性,进而增加水稻对氮素的吸收;添加质膜H+-ATPase抑制剂AMP能增加铝毒的氧化伤害,降低了 14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase的互作水平,减弱质膜H+-ATPase的活性和氢泵活性,水稻吸收氮素能力下降。这些实验结果表明,在铝胁迫下,可通过改变14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase的互作水平来改变质膜H+-ATPase的活性和氢泵活性,从而改变水稻对氮素吸收的能力,从分子层面进一步证实了质膜ATP酶参与水稻吸收氮素的调控机制。这为基因工程提高铝胁迫下水稻吸收氮素的效率提供了基因资源和策略。