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目的瘢痕疙瘩是以真皮层成纤维细胞大量增殖和细胞外基质（extracellular matrixs,ECM）过度沉积为主的病理性瘢痕,具有病变超出原病损范围、浸润生长和术后易复发的临床特征,其发病机制尚未完全阐明。本课题组前期工作发现瘢痕疙瘩成纤维细胞存在糖代谢重编程,发生有氧糖酵解,而低氧微环境中瘢痕疙瘩的糖代谢模式及其相关机制尚不明确。为阐明瘢痕疙瘩的发病机理,本研究探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibrobalsts,KFb）和正常皮肤成纤维细胞（normal skin fibroblasts,NFb）在常氧和低氧（3%）时糖酵解水平、线粒体功能、细胞功能和信号通路变化;研究PI3K/AKT信号通路对KFb糖代谢和细胞功能影响;探讨HIF1α通路和PI3K/AKT通路相互作用关系。方法（1）在光学显微镜下细胞计数确定促进KFb增殖的最佳低氧浓度。（2）qRT-PCR、Western Blot和酶活性试剂盒检测KFb和NFb在常氧和低氧（3%）时糖酵解酶 GLUT1、HK2、PFKFB3、PGK1、ENO1、PKM2 和 LDHA mRNA 表达、蛋白表达和酶活性。流式细胞术检测线粒体数量和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,酶活性试剂盒检测线粒体复合体Ⅰ-Ⅳ酶活性,电镜观察线粒体超微结构。Seahorse能量代谢仪监测糖酵解能力和线粒体呼吸能力。（3）流式细胞术检测KFb和NFb在常氧和低氧（3%）时细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体活性氧（mitochondrial ROS,mitoROS）含量,酶活性试剂盒检测NOX、SOD和GSH-Px活性。Western Blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的红绿色斑点数量,透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体超微结构。（4）以细胞计数、流式细胞术和transwell小室观察比较KFb和NFb在常氧和低氧（3%）条件下增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;qRT-PCR和Western Blot检测TGFβ1、ColⅠ 和 Col Ⅲ 表达。（5）Western Blot检测KFb和NFb在常氧和低氧（3%）时PI3K/AKT通路磷酸化水平和HIF1α表达。（6）通过KFb细胞增殖实验确定PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002浓度。（7）KFb经不同浓度LY294002（0、5和25μM）干预后,以Western Blot检测糖酵解酶 GLUT1、HK2、PFKFB3、PGK1、ENO1、PKM2 和 LDHA 蛋白表达水平;流式细胞术检测线粒体数量和膜电位,电镜观察线粒体超微结构;Seahorse能量代谢仪监测糖酵解能力和线粒体呼吸能力。（8）KFb经不同浓度LY294002（0、5和25μM）处理后,以流式术检测ROS和mitoROS含量。（9）KFb经不同浓度LY294002（0、5和25μM）处理后,以细胞计数、流式细胞术和transwell小室观察比较KFb在常氧和低氧（3%）条件下增殖、凋亡、迁移和侵袭。（10）以 LY294002（0 和 25μM）和 HIF1α 抑制剂 LW6（0 和 25μM）分别干预 KFb,Western Blot检测HIF1α、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达水平。结果（1）与其他氧浓度相比,3%低氧浓度促进KFb增殖效果最明显。（2）常氧条件下,KFb 糖酵解酶 GLUT1、HK2、PFKFB3、PGK1、ENO1、PKM2 和LDHA的mRNA水平、蛋白表达和酶活性均高于NFb;低氧（3%）时KFb和NFb中糖酵解酶的mRNA水平、蛋白表达和酶活性均较常氧显著增加。常氧条件下,KFb线粒体数量、膜电位和线粒体复合体活性均较NFb低;3%低氧处理后,线粒体数量和膜电位增加而复合体酶活性降低。电镜观察线粒体超微结构发现,常氧时KFb中线粒体肿胀、空泡状、嵴消失而NFb中线粒体超微结构正常;低氧（3%）处理后,KFb和NFb中线粒体超微结构维持原状。（3）Seahorse能量代谢仪监测显示,常氧条件下KFb的细胞外产酸率（extracellular acidification rate,ECAR）各项指标包括非糖酵解产酸率、基础糖酵解、最大糖酵解和糖酵解储备均高于NFb;而KFb耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）中非线粒体呼吸、基础呼吸、最大呼吸和呼吸储备均低于NFb;低氧（3%）处理后,NFb和KFb的各项ECAR指标（糖酵解储备除外）均明显增加,而OCR各项指标（质子漏除外）均明显降低。（4）常氧条件下,KFb中ROS和mitoROS水平较NFb高,氧化还原系统主要酶NOX、SOD和GSH-Px活性强于NFb。低氧（3%）时,NOX活性和mitoROS产生均增加,同时主要抗氧化酶SOD和GSH-pX活性增加。常氧条件下,KFb的LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于NFb,而p62蛋白表达水平低于NFb;此外KFb中红绿斑点数、自噬体和自噬溶酶体均高于NFb。经低氧（3%）干预后,LC3Ⅱ/Ⅰ 比值、红绿斑点数、自噬体和自噬溶酶体均明显增加,而p62蛋白表达明显降低。（5）在常氧条件下,KFb的增殖、迁移、侵袭和胶原合成能力均高于NFb,而凋亡水平低于NFb。低氧（3%）处理后NFb和KFb的增殖、迁移、侵袭和胶原合成能力增强,凋亡受到明显抑制,而且KFb对低氧（3%）的反应性比NFb强烈。（6）常氧条件下,KFb和NFb中几乎检测不到HIF1α,KFb中PI3K和AKT磷酸化水平明显高于NFb。3%低氧处理后,KFb和NFb中HIF1α表达量、PI3K和AKT磷酸化水平均较常氧明显增加。（7）抑制 PI3K/AKT 通路后,糖酵解酶 GLUT1、HK2、PFKFB3、PGK1、ENO1、PKM2和LDHA蛋白表达降低,线粒体数量和膜电位增加。Seahorse代谢仪显示,抑制PI3K/AKT通路后,ECAR关键参数明显下降,而OCR关键参数明显升高。（8）抑制PI3K/AKT通路后,氧化应激增强,其中ROS和mitoROS含量明显增加。（9）抑制PI3K/AKT通路后,KFb在常氧和低氧（3%）条件下的增殖、迁移和侵袭能力均下降,而凋亡水平上升。（10）抑制PI3K/AKT通路后,PI3K和AKT的磷酸化水平降低,HIF1α表达量下降。抑制HIF1α通路后,HIF1α表达降低,PI3K和AKT的磷酸化水平降低。结论本研究再次实验证实KFb存在糖代谢重编程,常氧条件下糖酵解能力增强,线粒体功能降低、超微结构异常;深入研究发现低氧微环境提高糖酵解水平、抑制线粒体功能,促进增殖、迁移、侵袭和胶原合成,并抑制细胞凋亡;最后实验证明PI3K/AKT通路参与调控KFb糖代谢,该通路抑制后糖酵解能力明显下降而线粒体功能恢复,最终抑制细胞增殖和促进凋亡;本研究结果有益于阐明糖代谢影响瘢痕疙瘩成纤维细胞功能促进瘢痕疙瘩增生的病理机理,为今后靶向糖代谢调控治疗瘢痕疙瘩提供一定理论依据。