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背景、目的和意义：大肠癌(colorectal cancer，CRC)是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，近30年来其发病率呈逐步上升趋势。业已证明，大肠癌的预后与早期诊断和治疗密切相关。由于目前尚未发现其特异的分子事件和肿瘤标志物，故在其早期诊治研究中普遍面临的问题是缺乏特异、准确、简便的生物学指标和实用方法。近年来随着分子生物学和分子免疫学的飞速发展，肿瘤的免疫防治研究取得很大进展，小分子抗体(small molecular antibody，SMA)由于分子量小，抗原性低，对实体瘤穿透性强等优点而成为研究热点，有望成为大肠癌免疫研究中有价值的分子蛋白而应用于其早期诊治。但抗体的免疫原性依然是临床应用的主要障碍，解决这一问题的途径是抗体的人源化及制备人源抗体。20世纪80年代末出现的噬菌体抗体库技术在制备人源抗体及筛选高亲合力抗体方面迈出了重要一步，可卓有成效地实现对特异性抗体片段的筛选和扩增，是目前制备小分子抗体的一种先进手段。抗体Fab段则是研究较多的一种小分子抗体，为完整抗体的三分之一，具有与完整抗体相同的抗原结合特异性及较单链抗体(single-chain fragment variable antibody，scFv)更高的抗原亲合力，它可融合表达在噬菌体外壳蛋白的C端，自动折叠成具有生物活性的空间构象，可以用特异性抗原筛选出阳性噬菌体克隆并导入大肠杆菌中扩增，从而获得高滴度的特异性抗体片段。本课题拟采用噬菌体抗体库技术，以本研究所构建的阳性重组菌XL1-blue-Pcomb3(含有大肠癌相关抗体重链Fd段和κ链基因)表达大肠癌相关抗体Fab段噬菌体呈现库，再以多种来源的可溶性多克隆大肠癌相关抗原筛选其多克隆相关抗体并行扩增，鉴定筛选后的抗体库与人大肠癌组织和细胞有无特异性结合活性，并尽可能筛选出与人大肠癌组织有较强结合活性的单菌落噬菌体抗体，为大肠癌的免疫诊治提供有效载体。材料与方法：1．鉴定阳性重组菌XLI．blue－Pcomb3的Fab基因库库容复苏重组菌 XL．blue．Pcomb3后铺板，挑取白色菌落提取质粒，以一组不同家族 抗体的前导肽和免疫球蛋白Fab段可变区N端第一骨架区（FR）DNA 序列的相对保守性而设计的5’端引物及按抗体恒定区基因序列而设 计的 3’端引物配对进行聚合酶链反应Oolymerase Chain Reaction， PCR），测定重链M段和。链的插入率，计算出 XLI七lueIcomb3的 Fab基因库库容。2．提取组织和细胞的抗原蛋白 将大肠癌组织和细胞用裂解缓冲液裂解 后低温高速离心取上清，即得组织和细胞的抗原蛋白，－70丫冻存。 共提取了3例用于构建抗体库的致敏大肠癌抗原蛋白（等体积混和得 AgA），13例非致敏大肠癌抗原蛋白（等体积混和得 AgB入 3种大肠癌 细胞株LOVO、HT－29、LS－174T抗原蛋白（等体积混和得AgC），此外， 还提取了其他大肠癌（20例）、胃癌（10例）、食管癌（10例）及正常肠 粘膜组织＊ 例厂胃癌 MGC803细胞和肝癌 HepG2细胞抗原蛋白。3．表达大肠癌抗体 Fab段原始库将阳性菌 XL lblue－Pcomb3扩增培养 后加入辅噬菌体VCSM13，超感染后制备成Fab噬菌体呈现原始库， 点印迹免疫染色检测其表面Fab段抗体的表达。4．筛选抗体库用碳酸盐包被缓冲液将AgA包被于酶标板上，加入原始 库使其与 AgA充分结合，磷酸盐吐温缓冲液…hosPhate buffer saline toween，PBST）洗涤未结合的部分，再用洗脱液洗脱下结合的部分， 加入到大肠杆菌XL七lue中感染扩增，经VCSM13超感染获得阳性 噬菌体抗体库后再行新一轮筛选。用AgA共筛选三轮得KM，同样 用 AgB、AgC进行筛选，得到KB3和 Kc3，将KA3、、KB3和 KC3等体积 混和得到KIniX。对每一轮筛选后的抗体库均以点印迹免疫染色检测 其表面Fab段抗体的表达。5．测定噬菌体抗体库滴度对每一轮洗脱下来的抗体库进行滴度的测 定，以检测噬菌体抗体是否得到了特异性富集。6．鉴定抗体库 用免疫组化和酶联免疫吸附实验 ＊nzyye linked immunosorbent assap ELISA）间接法鉴定 Killix与大肠癌组织和细胞 的特异结合活性，并取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和胃癌、肝癌 －4－ 细胞进行对照研究。 7．单菌落噬菌体Fah抗体的制备与鉴定用AgA筛选抗体库，第H轮淘 选至感染对数生长期的XLlblue后，取少量细菌铺LB平板，挑取转化 了重组质粒厂d＋叫的单菌落，经VCSM13超感染后制备单菌落噬菌 体Fab抗体。以ELISA间接法检测噬菌体抗体与大肠癌抗原的结合 活性。 结果： 经PCR检测 Fd片段及K链的插入率分别为 40％和 70％，Fd片段及 。链均插入质粒 Pcomb3的重组率为 28％，Fab段基因库库容约为 2．IX 10‘个克隆。经辅助噬菌体VCSM13超感染和 PEG8000沉淀浓缩后表达 的 Fab原始库滴度为 2石X 10‘千 J组大肠癌混合抗原分别对原始库 进行3轮筛选?