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牙周炎是一种慢性感染性疾病,以牙周支持组织的破坏为主要特点。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是G-菌细胞壁的外膜成分,能直接作用于牙周组织细胞,并激活宿主免疫反应,影响促炎因子、抗炎因子和趋化因子的分泌,在牙周炎的发生发展过程中具有重要作用。细菌及其产物对牙周组织的持续刺激,可能使机体对后续刺激的反应性减弱,产生内毒素耐受(endotoxin tolerance)。在牙周炎的漫长病程中,细菌及其产物对牙周组织的刺激是持续存在的,因此可能会产生耐受。中性粒细胞是牙周组织抵抗入侵致病菌的第一道防线,具有活跃的吞噬、杀菌和分泌多种细胞因子的功能。在牙周炎发生发展的过程中,内毒素耐受对中性粒细胞功能有何直接影响,尚不得而知。单核/巨噬细胞(monocyte/macrophage)是机体重要的免疫调节和效应细胞之一。它可直接吞噬病原体,参与非特异性免疫应答;能加工处理、提呈抗原,启动特异性免疫反应;可分泌促炎因子趋化因子和抗炎因子等,在维持促炎和抗炎的免疫平衡中发挥重要的调节作用。在内毒素耐受过程中,耐受的单核/巨噬细胞对中性粒细胞的免疫炎症反应是否存在间接影响,尚有待进一步研究。目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)LPS诱导的内毒素耐受对人中性粒细胞呼吸爆发、凋亡和细胞因子分泌水平的直接影响,以及耐受单核细胞对中性粒细胞趋化功能的间接影响,并探寻其可能机制,为进一步阐明牙周炎发生发展的免疫学机制提供实验数据。方法:1.采集健康志愿者外周血,密度梯度离心法分离获得中性粒细胞;人单核细胞株THP-1细胞购自中科院细胞库。2.采用1μg/ml P.gingiSvalis LP重复刺激,诱导中性粒细胞耐受,以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)LPS为阳性对照。采用流式细胞技术检测中性粒细胞呼吸爆发产生的活性氧(reactive species,ROS)水平和凋亡相关蛋白酶Caspase 3表达水平的变化,采用ELISA技术检测TNF-α分泌水平的变化。3.采用1μg/mlP.gingivalis LPS重复刺激,构建THP-1细胞耐受模型,计数THP-1细胞条件培养液上清趋化下,越过Transwell小室膜的中性粒细胞数量。同时,收集THP-1细胞条件培养液上清,采用ELISA技术检测THP-1细胞条件培养液上清中,趋化因子上皮来源的中性粒细胞活化肽78(epithelial neutrophil-activating peptide 78,ENA-78)表达水平的变化。结果:1.与刺激前相比,1μg/mlP.gingivalis LPS单次刺激后,中性粒细胞ROS水平无明显变化(p>0.05);而1μg/ml E.coli LPS单次刺激后,ROS水平较刺激前明显增高(p<0.05)。两种LPS分别重复刺激后,ROS水平较相应的单次刺激组明显降低(p<0.05)。2.两种LPS单次刺激后,中性粒细胞Caspase 3表达水平均与刺激前无明显差异(p>0.05),两种LPS分别重复刺激后,Caspase 3表达水平与相应的单次刺激组相比,均明显降低(p<0.05)。3.两种LPS单次刺激后,中性粒细胞TNF-α表达水平均明显升高(p<0.05);两种LPS分别重复刺激后,TNF-α水平则均较单次刺激后明显降低(p<0.05)。4.两种LPS单次刺激的THP-1细胞条件培养液上清刺激后,中性粒细胞趋化数量较无刺激的THP-1细胞培养液上清刺激组明显增多(p<0.05)。两种LPS重复刺激的THP-1细胞培养液上清刺激后,中性粒细胞趋化数量较相应的单次刺激的培养液上清刺激组明显减少(p<0.05)。ELISA检测显示,P.gingivalis LPS单次刺激后,THP-1细胞分泌的趋化因子ENA-78水平与刺激前无明显差别(p>0.05),E.coli LPS单次刺激后,ENA-78水平则较刺激前明显增高(p<0.05);两种LPS重复刺激后,ENA-78水平均较单次刺激后明显降低(p<0.05)。结论:内毒素耐受对中性粒细胞的免疫炎症反应具有调控作用。P.gingivalis LPS耐受的中性粒细胞,呼吸爆发、凋亡和TNF-α分泌水平均降低,耐受的THP-1细胞亦具有抑制中性粒细胞趋化的功能。上述改变可能有助于控制炎症反应的程度,避免过度的炎症反应造成的组织破坏,但也可能不利于组织有效清除入侵细菌。