脑卒中危害极大,目前是人类的第二大死亡原因,且发病率仍呈上升趋势。在我国,每年有280万人新发生脑卒中,140万人死于脑卒中。随着我国人口的老龄化,脑卒中的问题将日益严重,社会和经济将不堪重负。因此,寻找有效地防治措施至关重要。而针对脑卒中危险因素的有效处理,如降压,降脂,抗动脉粥样硬化以及相关的基因、蛋白调控,可有效地防治脑卒中。但令人遗憾的是,这些已知因素,仅占脑卒中危险因素60%,还有接近一半没能有效地发掘。而对于缺血性心脏病,超过90%的危险因素已被确定,并在心血管疾病的治疗中发挥着重要的作用。因此,脑卒中危险因素的发现还有很大的研究空间。利用现有的手段,发现更多危险因素,并针对其采取有效的治疗手段,对于脑卒中的防治更为有利。我们实验室具备2种高血压动物模型,自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)以及脑卒中倾向的自发性高血压大鼠(stroke prone spontaneously hypertensive rat, SHR-SP),二者的正常血压对照动物为京都种大鼠(Wistar Kyoto rat, WKY)。SHR-SP来源于SHR,都有高血压,但与后者不同的是,SHR-SP到一定年龄即可发生脑卒中。通过基因芯片技术、蛋白质组学双向电泳技术、质谱分析等手段,对SHR-SP和SHR进行比较(以利于去除高血压引起的差别),我们找出了一系列差异蛋白,发现乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)等水平显著地下调。因为排除了高血压等因素,这些差异蛋白可能与脑卒中相关。ALDH2是存在于线粒体的一种酶,参与乙醇的代谢过程,促进毒性中间产物乙醛(乙醇经脱氢酶催化产生)转化为乙酸,从而发挥酒精解毒作用。除了乙醛,ALDH2对于机体内产生的其他有毒醛类,包括4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE),都有明确地解毒作用。本课题以ALDH2为中心,试图阐明ALDH2防治脑卒中的作用；确定4-HNE与脑卒中的因果关系以及4-HNE预测缺血性脑卒中发生的可行性。提出假说：ALDH2可能通过清除脑缺血过量产生的毒性代谢醛类4-HNE等,发挥神经保护作用；4-HNE可能是一种重要的脑卒中危险因素。根据此假设,我们也进行了相应的实验。具体实验结果如下：实验一：ALDH2在SHR-SP脑组织中低表达利用荧光差异二维电泳实验技术平台,比较分析SHR和SHR-SP脑组织差异蛋白的表达。结果有44个差异蛋白点得到串联质谱的鉴定。其中,ALDH2在SHR-SP脑组织中显著低表达。这一结果在随后的免疫印迹(Western Blot, WB)实验得到验证。实验二：ALDH2对神经元缺氧缺糖损伤的保护作用在原代培养的神经元上,ALDH2激动剂Aldal(10μM)能减轻缺氧缺糖(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)诱导的神经元凋亡(16.7±0.62%vs.28.9±0.12%invehicle),而抑制剂Cya(1mM)则促进神经元凋亡(45.2±3.26%vs.28.9±0.12%invehicle)。利用慢病毒使ALDH2过表达(约2倍)或基因沉默(约0.16倍)也得到了类似的结果。首先通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI值=10),保证转染效率超过90%。过表达ALDH2的神经元对能缺氧损伤的耐受力增强(12.6±0.2%vs.57.8±2.1%),而干扰ALDH2表达后神经元对缺血缺氧损伤易感性增加(62.1±2.4%vs.46.1±0.7%)。实验三：ALDH2对整体急性脑缺血损伤的保护作用Sprague-Dawley(SD)大鼠侧脑室给予ALDH2激动剂Aldal (50μg/5μl), ALDH2活性增加109%,大脑中动脉栓塞(niddle cerebral arterial occlusion, MCAO)24h半脑梗死面积降低40%；而侧脑室给予ALDH2阻断剂Cya(1mg/5μl)后,ALDH2活性降低60%,脑缺血梗死面积增大30%。我们将表达ALDH2的慢病毒载体(LV-ALDH2)、对照病毒(LV-GFP)及RNA干扰ALDH2的慢病毒载体(sh-ALDH2)、对照病毒(sh-Scramble)利用立体定位仪注射到SD大鼠的脑组织中,3周后,WB验证ALDH2在脑局部的表达情况,行MCAO手术。与相应对照病毒组相比,LV-ALDH2使ALDH2在脑局部表达增加约100%,sh-ALDH2使ALDH2脑局部表达降低约60%。过表达ALDH2使MCAO术后24h半脑梗死面积从38%降至12%,神经行为学损伤也得到缓解；而干扰ALDH2表达则得到相反的结果,脑缺血梗死面积从37%增至49%,神经行为学损伤也加重。实验四：4-HNE在SHR-SP中高表达并与其寿命呈负相关比较WKY,SHR以及SHR-SP血清4-HNE含量,3月龄时,SHR与WKY血清4-HNE水平无差别,SHR-SP显著升高；6月龄时,SHR血清4-HNE含量较WKY略有增加,SHR-SP血清4-HNE高表达,是WKY、SHR血清含量的3倍以上。利用WB方法测定3组动物6月龄时脑皮层4-HNE,SHR-SP脑组织含量显著高表达。另外,我们检测27只8月龄SHR-SP血中4-HNE水平,同时记录其死亡时间,发现4-HNE与SHR-SP生存时间呈显著的负相关(r=-0.602,P<0.001)。实验五：4-HNE在脑卒中患者以及脑卒中倾向人群高表达我们进一步通过两种临床实验观察4-HNE与脑卒中的关系。一种是病例对照研究。以年龄、性别等相匹配人群为对照,测定缺血性脑卒中病人在发病0-3d,7-14d以及3-6月不同时间段4-HNE变化情况,发现各期脑卒中患者4-HNE含量均高于对照人群,其中7-14d的4-HNE水平最高(15.5±2.8,18.2±3.3,14.2±1.7vs.9.1±1.9mg/ml in control,P<0.001)。另一种是队列研究。与北京朝阳医院蔡军副教授合作,利用他们2004年保存的1242名社区人群血浆样品,以及完整的随访材料(截止到2011)开展本试验。8年的随访中,共有21例在随访中发生脑卒中。我们从其余未发生卒中人群中随机取45例作为对照组。未发生卒中与发生卒中人群基本信息比较发现：饮酒率、谷丙转氨酶(ALT)与血肌酐有显著差异,但ALT与血肌酐均在正常范围内,其余信息均无差异。并且,21名发生卒中人群的4-HNE含量明显高于未发生卒中人群(12.1±1.6vs.9.6±1.6mg/ml,P=0.0007)。实验六：4-HNE加重脑缺血的作用被ALDH2取消在脑缺血情况下,醛4-HNE显著增加,并且4-HNE能进一步加重急性脑缺血损伤。SD大鼠侧脑室注射4-HNE,显著地加重MCAO导致的急性脑缺血损伤(31.25[μg/5μl,51.2±4.5%vs.32.8±2.7%in vehicle,P<0.01);4-HNE促进OGD诱导的神经元凋亡(0.1mM,44.6±7.2%vs.29.8±4.8%in vehicle,P<0.01)。我们证实：OGD可以诱导神经元内4-HNE表达增加,而这一作用完全被ALDH2激动剂Aldal所取消,而被ALDH2抑制剂Cya所促进,提示：ALDH2可以有效地代谢脑内4-HNE。LV-GFP微注射大鼠脑皮层组织,侧脑室给予4-HNE (31.25μg/5μl)后进行MCAO,术后24h血清4-HNE含量增加62%,脑缺血梗死面积增加45.9%。而在LV-ALDH2大鼠上,侧脑室给予4-HNE后4-HNE含量及脑缺血损伤均没有明显变化(567±17.1vs.417±8.1ng/ml;13.2±6.9%vs.12.3±6.7%)。实验七：6%酒精对脑缺血损伤以及ALDH2的影响我们发现：6%酒精(ethanol,EtOH)能减轻急性脑缺血梗死面积(25.1±3.4%vs35.2±2.3%),缓解神经行为学损伤。6%酒精同样能延缓SHR-SP脑卒中的发生(Logrank8.9984,P=0.0027)。与对照组相比,生存时间增加了约33%。酒精6%并不增加脑或者肝ALDH2的表达,但能显著增加脑皮层ALDH2活力(138±38.9%vs.100±17.2%)。利用二维电泳技术,我们发现：6%酒精诱导ALDH2等电点分布发生改变,可能是由于ALDH2发生磷酸化所引起,但仍需进一步实验证实。在正常SD大鼠上,6%酒精并不影响血清4-HNE的水平(159±54.0vs.170±45.8ng/ml)。而对于MCAO大鼠,适量酒精显著降低了术后24h血清4-HNE的含量(464±29.3vs.608±53.1ng/ml)以及缺血脑组织4-HNE的表达。实验八：ALDH2介导6%酒精对脑缺血损伤的保护作用以上实验发现6%酒精能增加ALDH2的活力,因此,我们下一步验证ALDH2是否参与了酒精对脑缺血的保护作用。侧脑室给予ALDH2抑制剂Cya (1mg/5μl)后,6%酒精的保护作用被取消。对于脑局部微注射sh-ALDH2的大鼠,6%酒精并没有减轻急性脑缺血损伤,也没有减轻MCAO术后4-HNE的增加,sh-ALDH2组及sh-ALDH2+EtOH组均呈现高水平的4-HNE,即基因沉默ALDH2后,取消了6%酒精对脑缺血的保护作用以及对4-HNE降低的作用。实验九：酒精的保护作用依赖于PKCε在神经元上,30mM酒精作用4h能促进神经元PKCε的磷酸化(增加68%),也能促进神经元内ALDH2与PKCε的相互结合。PKC有很多亚型,酒精对PKCa则无此作用。在神经元或脑局部,转染携带PKCε的慢病毒(LV-PKCδ)增加PKCε的表达,以及基因沉默PKCε的慢病毒(sh-PKCε)来干扰PKCε的表达,发现：神经元过表达PKCε可以减轻OGD诱导的缺氧缺糖损伤(12.5±0.1%vs.38.2±0.1%)；而干扰神经元PKCε的表达,则作用相反(55.6±2.9%vs.46.3±0.7%)。脑局部过表达PKCε也可以减轻急性脑缺血损伤(26.2±4.1%vs.34.8±3.9%in LV-GFP),且此保护作用被sh-ALDH2所取消(49.8±14.7%in LV-PKCε+sh-ALDH2vs.34.8±4.5%in LV-GFP+sh-ALDH2)。脑局部基因沉默PKCε后,大鼠脑内ALDH2活力减少68%,而且完全取消了6%酒精对ALDH2的激活作用。脑局部微注射sh-PKCε的大鼠,同样取消了6%酒精对脑缺血的保护作用(42.0±2.7%vs.38.8±6.9%without ethanol)以及减少4-HNE的作用(1054.1±107.9vs.952.3±71.6ng/ml without ethanol)。结论：1.增加ALDH2含量或活力,可减轻缺血性脑损伤,其机制可能通过清除脑内过量产生的毒性代谢醛类4-HNE等,发挥神经保护作用。2.4-HNE可能是一种新的脑卒中危险因子。3. PKCε可调节ALDH2活性,其神经保护作用通过ALDH2发挥。4.适度饮酒通过激活PKCε-ALDH2通路,减轻缺血性脑损伤。