干细胞是一类在特定条件下具有自我更新、增殖和分化等多种功能的细胞,它可以根据机体需要有组织地分化产生更多特异性的细胞类型,达到组织再生的目的。间充质干细胞（MSC）是目前临床应用和研究最成熟的干细胞类型之一。CD271是一种存在于骨髓、脐带等多种组织来源的间充质干细胞以及肿瘤干细胞的特异性标记分子,研究表明抗CD271抗体有望应用于间充质干细胞和肿瘤干细胞的分离、富集及靶向,因此高效靶向人CD271的单克隆抗体在基础研究及应用转化方面均具有重要价值。氨基酸序列的亲水性、柔性、二级结构以及翻译后修饰等多项因素决定了蛋白分子的抗原性。大多数蛋白分子的疏水性残基都埋藏在分子内部,而暴露在分子表面的N-和C-末端肽段具有较好的柔性、带电性以及亲水性,因此是成为抗原良好的选择。CD271的胞外区富含N-和O-糖基化和磷酸化修饰以及4个重复的半胱氨酸富集区（CRD1-4）,具有复杂的蛋白特性和二级结构,而靠近细胞膜的stalk区无糖基化、磷酸化修饰或高级空间结构,结构稳定,识别此区域的抗体理论上具有较好的通用性。目前关于人CD271单克隆抗体的研究较少,有明确报道的抗体识别CRD1区,因此,我们选取stalk区作为靶点开发新型的抗CD271单克隆抗体,为该领域研究提供新的工具。我们首先设计了胞外区全长（CD271F）及截短的stalk区（CD271T）两种重组人CD271蛋白,并分别采用哺乳动物细胞和大肠杆菌两种系统进行表达纯化,先后应用于小鼠免疫及效价检测、杂交瘤细胞株筛选阶段,以保证获得能够识别天然结构抗原的抗体。经过杂交瘤融合及筛选阶段,我们最终获得了7株杂交瘤细胞,采用诱生腹水法纯化获得单克隆抗体,测得7株抗体的平衡解离常数均为n M水平,且流式细胞术检测其均能识别人间充质干细胞（MSC）表面的CD271分子。我们选取与MSC结合最优的一株进一步检测,证实其也能够识别肿瘤细胞A375-S2和SGC表面的CD271分子。通过杂交瘤细胞测序获得该抗人CD271单克隆抗体株的可变区序列,可用于后续基因工程抗体的研究。哺乳动物细胞表达重组蛋白、单克隆抗体主要采用瞬时表达和稳定表达两种方式,其中稳定表达能够获得持续稳定的质量和产量,但稳定细胞株的构建较为困难。传统的稳定细胞株主要通过瞬时基因表达质粒的随机整合及后续筛选,目的基因（GOI）被转染到宿主细胞系中,其基因插入位点无法控制,细胞株在长期培养的过程中会表现出异质性,从而影响目的蛋白的产量及质量。HEK293细胞是最常用的哺乳动物细胞表达宿主之一,广泛应用于瞬时表达重组蛋白或抗体,本研究结合CRISPR/Cas9介导的基因定点整合方法,建立高效的HEK293细胞的稳定细胞株构建技术,提高HEK293细胞在生物技术药物领域的应用水平。我们以腺相关病毒位点1（AAVS1）为整合位点,首先验证了以EGFP作为模式蛋白的定点整合HEK293T细胞系的可行性,并进一步以CTLA4Ig为模式蛋白建立了多株稳定表达细胞株。我们对CTLA4Ig稳转细胞株构建过程及筛选克隆的CTLA4Ig表达能力进行了一致性评估,证实HEK293T细胞中采用CRISPR/Cas9技术介导AAVS1位点的基因定点整合能够实现高效的稳定细胞株构建,且细胞株之间的产量一致性达到83%以上。我们所建立的方法大大简化了HEK293T稳定细胞株构建流程,具有较好的应用潜力。综上,本课题制备了两种CD271重组蛋白应用于小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选及鉴定,成功获得高效靶向人CD271分子stalk区的单克隆抗体杂交瘤细胞株和相关序列,并证实所得到的抗体能够特异性识别人间充质干细胞和肿瘤细胞表面的CD271分子。为提高单克隆抗体制备效率,我们采用CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术,实现了重组HEK293T稳定细胞株的高效构建,且证实该方法具有较好的可靠性和成功率,为本课题所筛选的抗人CD271单克隆抗体的制备奠定了工艺基础,并能够广泛应用于生物药物的生产及研发。