背景和目的:骨肉瘤(ostesarcoma,OS)是常见于青少年及老年的骨肿瘤。骨肉瘤的标准治疗方案包括手术切除局部病灶及术前术后使用化疗药物,使用此方案有效的提高了骨肉瘤的患者5年生存率(65%)。然而,近三十年来,由于肿瘤异质性的存在,骨肉瘤的临床治疗一直未取得明显进展。因此,深入研究骨肉瘤的致病机制,寻找新的分子靶点,对临床骨肉瘤的治疗开发具有重要意义。LIM同源框基因2(LIM-homeobox gene 2,LHX2)在许多肿瘤中过表达,且与肿瘤生长、转移及不良预后关系密切,但LHX2在骨肉瘤中是否具有致癌潜质尚未见报道。自噬与肿瘤的关系密切且复杂,其在肿瘤中的作用是一把双刃剑,并且参与调节骨肉瘤增殖、转移、凋亡等多种恶性表型。MicroRNA(miRNA)是一类20个左右核苷酸大小的、单链非编码RNA。成熟miRNA靶向下游目标基因mRNA的3’UTR区域使其表达沉默,从而在细胞内行使至关重要的生理功能,同时也被证明与肿瘤有着密不可分的关系。既往研究表明miR-129-5p抑制骨肉瘤的生长、转移,但其内在细胞学机制并不十分清楚。本课题旨在阐明LHX2在骨肉瘤中的表达情况、作用及可能调控机制,并从上游miRNA的角度分析其在骨肉瘤中异常表达的调控机制,为临床骨肉瘤的防治提供新的策略和干预手段。方法:1.LHX2在骨肉瘤中的表达及与临床病理参数的关系:1)GEO数据库分析18对配对的骨肉瘤组织中LHX2表达情况;2)组织芯片分析40例骨肉瘤患者中LHX2的蛋白表达分布情况;3)qRT-PCR、Western blot检测成骨细胞hFOB 1.19及骨肉瘤细胞系143B、MG62及Saos-2中LHX2的mRNA及蛋白表达情况;4)收集71例临床骨肉瘤组织病理切片,免疫组化检测LHX2蛋白表达情况,并分析LHX2蛋白表达高低与骨肉瘤患者临床参数、预后相关性。2.LHX2与骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭的关系:1)使用RNAi技术构建LHX2沉默慢病毒载体(Lv-shLHX2),与对照慢病毒分别转染骨肉瘤细胞143B、MG63后,使用qRT-PCR、Western blot验证LHX2敲低效率;2)CCK8、克隆形成实验检测LHX2敲低后细胞增殖能力变化;3)划痕实验、Transwell迁移侵袭实验检测LHX2敲低后细胞迁移、侵袭能力变化;3.LHX2与骨肉瘤细胞自噬的关系及其可能调控机制:1)骨肉瘤数据库R2预测LHX2与自噬标志基因的相关性;2)qRT-PCR、Western blot检测LHX2沉默后骨肉瘤细胞株中自噬标志基因、蛋白的表达;3)GFP-RFP-LC3融合实验观察自噬体形成情况;4)Western blot检测mTOR通路表达与活性。4.LHX2与骨肉瘤生长、转移的关系:1)将带荧光素酶的的143B细胞稳定转染对照及shLHX2慢病毒后,经原位注射法构建骨肉瘤原位自发肺部转移模型;2)绘制原位骨肉瘤生长曲线记录各组瘤体生长速度差异;3)解剖观察、肺部HE染色、活体成像观察裸鼠肺部转移情况;4)免疫组化检测骨肉瘤瘤体中增殖标志蛋白Ki67、自噬标志蛋白LC3B的表达情况。5.miR-129-5p靶向调控LHX2:1)生物信息预测软件Targetscan筛选可能靶向LHX2 3,UTR区域的microRNA,根据两者结合序列设计点突变慢病毒载体;2)双荧光素酶实验验证miR-129-5p是否能与LHX2的3’UTR区域结合。3)过表达及抑制miR-129-5p后,Western blot检测下游LHX2蛋白表达水平变化。6.miR-129-5p通过调控LHX2介导骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭:1)将转染对应慢病毒载体的143B及MG63细胞进行分组:阴性对照组、miR-129-5p组、miR-129-5p+LHX2组。CCK8实验、克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力;2)划痕实验、Transwell迁移侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力。7.miR-129-5p通过调控LHX2介导骨肉瘤生长、转移:1)将稳定转染对应慢病毒载体的带荧光素酶标签的143B细胞分为三组:阴性对照组、miR-129-5p组、miR-129-5p+LHX2组,经原位注射法构建骨肉瘤原位自发肺部转移模型;2)绘制原位骨肉瘤生长曲线,记录各组瘤体生长速度差异;3)解剖观察、肺部HE染色、活体成像观察裸鼠肺部转移情况。结果:1.GEO数据库分析表明,在18例骨肉瘤患者中,相比正常癌旁组织,LHX2在骨肉瘤中表达显著上调(P=0.0069);40例骨肉瘤组织芯片免疫组化染色中有34例样本LHX2表达为阳性(34/40,85%),其中有47%(19/40)的样本IHC染色强度为(+),33%(13/40)的样本IHC染色强度为(++),5%(2/40)的样本IHC染色强度为(+++);与成骨细胞系hFOB 1.19相比,LHX2的mRNA及蛋白表达水平在三株骨肉瘤细胞系(Saos-2、143B、MG63)中均显著升高;在71例临床骨肉瘤患者组织中,LHX2表达与肺部转移(P=0.013)、Enneking分期(P=0.007)显著相关,Kaplan-Meier(KM)分析表明LHX2高表达预示更差的整体生存率(P=0.0052)和无转移生存率(P=0.0414)。2.成功将三种shLHX2慢病毒载体转染143B及MG63细胞。转染shLHX2后细胞中LHX2的mRNA及蛋白水平均明显下降,shLHX2-3靶点的LHX2敲低率最高;CCK8实验、克隆形成实验结果表明,LHX2沉默后细胞增殖率、集落形成数均显著降低;划痕实验、Transwell迁移侵袭实验结果表明,LHX2沉默后细胞迁移、侵袭被抑制。3.R2数据库预测结果表明在127例骨肉瘤中LHX2表达与自噬相关基因LC3,Beclin1等表达呈负相关;qRT-PCR、Western blot结果表明LHX2沉默后自噬相关基因mRNA及蛋白表达水平升高;GFP-RFP-LC3融合实验结果表明LHX2沉默后自噬体量显著增多;Western blot结果表明LHX2沉默后,Akt、mTOR、ULK1整体表达无明显变化,p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)表达降低,p-ULK1(Ser757)显著升高,4.裸鼠荷瘤实验表明,相较于对照组,LHX2沉默组裸鼠原位肿瘤生长速率减慢,肺部转移灶数量减少。瘤体免疫组化结果显示LHX2沉默组增殖标志蛋白Ki67表达降低、自噬标志蛋白LC3B表达上升。5.双荧光素酶实验结果表明miR-129-5p可以靶向LHX2的3’UTR区域;Western blot实验结果表明在骨肉瘤细胞143B及MG63中,miR-129-5p过表达组LHX2蛋白表达被显著抑制。与之相反,转染Anti-miR-129-5p慢病毒后,LHX2蛋白水平显著升高。6.CCK8、克隆形成实验结果表明,过表达miR-129-5p后细胞增殖率及克隆形成能力降低,结合LHX2过表达慢病毒载体后,细胞增殖率、克隆形成能力被部分回复;划痕实验、Transwell迁移侵袭实验结果表明,过表达miR-129-5p组细胞迁移、侵袭被显著抑制,共转染LHX2过表达慢病毒后,细胞迁移、侵袭能力被部分回复。7.裸鼠荷瘤实验表明,相较于对照组,miR-129-5p过表达后裸鼠原位肿瘤生长速率减慢,肺部转移灶数量减少,结合LHX2过表达慢病毒载体后,原位肿瘤生长速率、肺部转移灶数量被部分回复。结论:LHX2在骨肉瘤组织及细胞中表达均显著上调,且与骨肉瘤肺部转移、Enneking分期及不良预后显著相关。沉默LHX2后骨肉瘤生长、转移能力显著下降,自噬水平提高,其机制可能与其失活Akt/mTOR/ULK1信号通路相关。miR-129-5p通过直接靶向调控LHX2抑制骨肉瘤生长、转移。