研究背景慢性肾脏病(chronic kidney diseases, CKD)是绝大多数肾脏疾病的临床统称；除了急性肾炎和急性尿路感染(肾脏急性炎症性疾病)外,都可以归属慢性肾脏病的范围；本病是一个缓慢发展相对良性的疾病(或共同的临床病理过程)；各种泌尿系统疾病包括糖尿病肾病、原发性肾小球疾病、中毒性肾病、良性小动脉性肾硬化症、缺血性肾病、梗阻性肾病等若未能有效及时诊治,均可导致病情进展、恶化或随病程迁延,发展成为慢性肾功能不全或肾衰竭,最终形成尿毒症。肾脏纤维化是各种慢性肾脏病的最终结果和必然结局。从病理上来说,肾脏纤维化是多种慢性肾脏病的共同病理基础,同时也是各种慢性肾脏病发展为终末期肾衰竭的重要途径。肾脏纤维化包括肾小球纤维化、肾小管纤维化和肾间质纤维化,三者密切相连,都与肾功能下降程度直接相关。无论肾小球、肾小管、还是肾间质,巨噬细胞的活化、组织内细胞外基质(ECM)产生及ECM转换失去平衡等是它们纤维化的过程和机制中恒定的细胞分子事件。细胞外基质产生细胞主要包括有：成纤维细胞、小管上皮细胞、肾小球系膜细胞及局部浸润的单核细胞,这些细胞可转分化成为表达α-SMA的MFB,肌成纤维细胞的表达产物主要是α-SMA,现已认为α-SMA是肌成纤维细胞的标志物且具有特异性,另它是肾小球疾病系膜细胞表型转化和受损激活的标志。足细胞是高度分化的细胞,不可再生,它形成多重指突状足突。相邻的足突之间相互连接形成裂孔,形成一层裂孔隔膜,附着在肾小球毛细血管基底膜的外层。足细胞通过减弱肾小球基底膜的向外膨胀作用起到稳定肾小球结构的作用,足细胞功能的缺失在蛋白尿形成过程以及肾小球纤维化的发生发展中起重要作用,最终可引起肾脏纤维化。肾脏纤维化的本质是过度产生的胞外成分代替了肾脏固有结构。近年来的研究显示,合成细胞外基质的成纤维细胞和肌成纤维细胞来源的重要途径是已分化上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。EMT是肾脏纤维化的过程中早期和可逆的变化。假如能够逆转足细胞EMT,将会有力阻断CKD的发展。研究足细胞转分化的机制,成为进一步探明肾脏纤维化发生机制的重要的切入点和突破口。晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products, AOPPs)最早是在血液透析的患者循环中发现的氧化修饰蛋白,体外试验提示,AOPP不仅成为氧化应激的标志物,还能够激发单核细胞及中性粒细胞的呼吸爆发,也可能是炎症的中介因子。血浆晚期氧化蛋白产物的蓄积在糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏病等疾病中非常常见。近年的研究显示,在残余肾模型中血浆AOPPs的慢性蓄积显著增加了尿蛋白的排泄并加速了肾小球硬化。慢性肾脏病患者(如IgA肾病)循环中AOPP水平与肾脏病进展速度相关,蛋白质氧化产物潴留水平与慢性肾脏病的微炎症反应相关。近来,AOPPs在CKD的致病作用逐渐引起广泛关注,有学者研究发现AOPPs可诱导肾小管上皮细胞及足细胞发生EMT,这提示CKD发病机制的早期关键环节可能是AOPPs导致足细胞发生了EMT。红景天是蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本或亚灌木野生植物,因花、根、茎之浸液均为红色而得名。红景天苷是其主要的活性成分。有研究观察红景天苷对过氧化脂质(LPO)、大鼠肝脏匀奖超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、血清中LPO以及还原型谷胱甘肽-Px(GSH-Px)的影响,结果显示红景天苷可以显著提高大鼠肝脏GSH-Px活性和SOD活性,抑制大鼠血清和肝脏LPO的生成,说明红景天苷具有较强的抗脂质过氧化作用。还有证据表明红景天可改善低氧诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化、减少α-SMA的表达、减少细胞外基质的增加,起到抑制肾小管上皮细胞及间质细胞向成纤维细胞转化的作用,从而能够缓解肾间质的损害,防治肾间质纤维化。本实验通过Western蛋白印迹分析技术,探讨红景天对AOPPs诱导小鼠足细胞转分化的影响。一、研究目的观察AOPPs培养对小鼠足细胞Grp78、CHOP以及α-SMA、nephrin、 podocin蛋白表达的影响及红景天干预后Grp78、CHOP、α-SMA、nephrin、 podocin蛋白表达的变化。探讨红景天是否可以通过ERS途径从而逆转小鼠足细胞EMT。二、研究方法1.制备AOPP:采用Witko-Sarsat等介绍的方法,将人血清白蛋白(HSA)与次氯酸溶液以1/140的摩尔比例混合,室温下反应30min (25~30℃),在无菌PBS中透析24小时以去除残留次氯酸,制备的AOPP-HSA加入β-巯基乙醇终止反应,离心超滤30min,加入适量PBS冲洗,再次离心超滤。AOPP含量通过测定酸性条件下340nm处吸光度值,以氯氨T为标准取得。2.小鼠永生性足细胞培养传代转入37℃不含γ-干扰素的RPMI1640培养液中,5%CO2细胞培养孵箱继续分化后使用。3.观察AOPP刺激后的足细胞形态并检测细胞表达α-SMA蛋白最大效应剂量点及最佳效应时间点,得到最大效应剂量点AOPP浓度为200μg/ml,最佳效应时间点为24小时。4.根据实验目的将全部细胞分成10组培养：MPC5空白对照组.MPC5+BSA组、MPC5+AOPP组、MPC5+AOPP+salidroside (0.1μmol/L)组、MPC5+AOPP+salidroside (1μmol/L)组、MPC5+AOPP+salidroside (10μmol/L)组、MPC5+AOPP+salidroside (100μmol/L)组、MPC5+AOPP+salidroside (200μmol/L)组、MPC5+thapsigargin (0.25μmol/L)组、MPC5+thapsigargin (0.25μmol/L)+salidroside (200μmol/L)组。5.将各组细胞分别培养,于24h时收集细胞以Western blot方法检测Grp78、 CHOP、α-SMA、nephrin、podcin的蛋白表达水平。三、结果1. Western blot测定各组Grp78及CHOP的蛋白表达水平观察1-3组,空白组及白蛋白组基本不表达Grp78及CHOP蛋白；在AOPPs (200μg/ml)作用后,足细胞Grp78、CHOP蛋白表达增高(P<0.01)；不同浓度红景天(0.1μmol/L、lμmol/L,10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)干预后,Grp78、CHOP蛋白表达降低(P<0.05)且呈剂量依赖性下降(P<0.05)。根据相关文献报道Thapsigargin作为内质网应激诱导剂可特异性的作用于内质网,而对其他细胞器无干扰,本实验观察到毒胡萝卜素同样可引起Grp78、CHOP蛋白表达增高(P<0.01),红景天干预后毒胡萝卜素组的Grp78、CHOP蛋白表达降低(P<0.01)。2. Western blot测定各组α-SMA、nephrin、podocin的蛋白表达水平观察1-3组,与空白组及白蛋白组对比,AOPPs (200μg/ml)作用后,足细胞α-SMA蛋白表达水平增高而nephrin及podocin蛋白表达水平降低(P<0.01);不同浓度红景天(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)干预后,α-SMA蛋白表达水平降低及nephrin、podocin蛋白表达增高(P<0.05)。毒胡萝卜素作用于足细胞可引起α-SMA蛋白表达增高及nephrin、 podocin蛋白表达降低(P<0.01)；红景天干预后毒胡萝卜素组足细胞α-SMA蛋白表达水平降低及nephrin、podocin蛋白表达水平增高(P<0.01)四、结论本研究成功观察到AOPPs刺激下培养的足细胞Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白水平升高,同时有nephrin及podocin蛋白表达水平的下调。红景天作为干预条件,作用后Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达水平下降而nephrin、 podocin的表达升高,提示红景天可以逆转AOPP对小鼠足细胞的转分化作用,其可能通过ERS途径发挥作用。