背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)是威胁现在社会人类健康的一种重要疾病,其未来的发展趋势令人担忧。根据世界卫生组织的报告,现在糖尿病威慑着世界上1.7亿人口的健康,并且这一数量在2030年会超过3亿。大约三分之一的糖尿病患者会出现肾功能的持续恶化,并且最终需要透析和肾移植手术来治疗。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的初期症状可不明显,主要包括肾小球滤过率的增加和微量白蛋白尿的上升,之后会逐渐发展成为临床蛋白尿直至终末期肾病。其主要原因是肾小球滤过功能的失调,包括肾小球肥大、毛细血管基底膜增厚、以及肾系膜基质增生。对糖尿病肾病的预防和治疗已经成为全球性关注的焦点。迄今为止,已经有一些手段用于糖尿病肾病的防治,包括控制血糖、降低血压、降脂以及控制肾素血管紧张素系统等手段。这些手段虽然会有一些效果,但是都远远无法达到治疗或预防糖尿病肾病的目的。因此,现在急需了解糖尿病肾病的发病机制并且研究一些新的有效的治疗手段。高血糖、高血脂和炎症是糖尿病最主要的代谢失调表现。这三种现象都能够激发活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)的产生。活性氧能被多种病理条件诱发,并且被认为是高血糖导致组织损伤的主要作用机制。目前通用的观点认为过多活性氧的产生是导致糖尿病肾病发病的主要原因。活性氧不仅能够直接破坏细胞中的生物大分子,还能够作为信号传导的信号分子,激活一系列的信号通路。活性氧调节高糖诱导的信号通路并且激活肾脏细胞中促纤维化基因的转录表达。一些抗氧化的药物和疗法已经在细胞和动物水平上得到了广泛的研究和验证,正等待着进一步的临床验证。核因子E2相关因子2(Nrf2)是调节细胞内氧化还原状态的主要蛋白因子。近年来的一些研究表明,Nrf2能够在细胞水平和一些动物的糖尿病并发症模型中阻止高糖诱导产生的氧化损伤。当细胞中有氧化压力产生或者有亲电子的物质产生时,Nrf2被活化并且转位到细胞核中,Nrf2结合到氧化反应元件(ARE)上,诱导一系列基因的表达,包括：谷胱甘肽转移酶、NADPH醌氧化还原酶、γ谷氨酰半胱氨酸合成酶和血红素氧化酶1等。这些被Nrf2诱导表达的基因在细胞解毒、抗氧化和抗炎症反应中起到至关重要的作用。在细胞没有受到氧化压力攻击的正常情况下,Nrf2被其抑制蛋白INrf2结合控制在细胞质中而不能活化进入细胞核。Nrf2的抑制蛋白(INrf2)又被称为Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1),它通过结合肌动蛋白细胞骨架,将Nrf2控制在细胞质中。INrf2还能够诱导Nrf2的泛素化,并通过蛋白酶体的途径导致Nrf2的降解。蛋白质的泛素化降解途径需要E1、E2和E3酶分别将泛素活化,结合和连接到需要降解的目标蛋白质上。INrf2能够结合泛素E3连接酶,并作为其接合蛋白。对于Nrf2的降解来说,作为脚手架蛋白的Cu13和Rbxl蛋白组成E3连接酶复合物,并招募E2酶。INrf2通过其N端的BTB/POZ结构域结合Cu13蛋白质,同时通过其C端的Kelch结构域结合Nrf2蛋白,将Nrf2泛素化,最终通过26S蛋白酶体将Nrf2降解。大量的氧化应激因素及一些药物会导致Nrf2从INrf2上解离,从而使Nrf2摆脱泛素化降解,并使Nrf2活化,进入细胞核中刺激转录发生。研究表明INrf2蛋白的Kelch (DGR)结构域在进化上是非常保守的,INrf2能通过这一结构域结合许多蛋白。这些被INrf2结合的蛋白除了研究非常多的Nrf2蛋白以外,还包括Nrf1、PGAM5、前胸腺素α(prothymosin-a)、fetal Alz clone1和IKKβ。这说明INrf2能够通过结合不同的蛋白参与细胞中不同的信号通路和生物过程。最近的报道显示,INrf2能够结合和降解抗凋亡的Bcl-2蛋白,参与细胞的凋亡进程。还有的研究表明INrf2能够通过其结合的PGAM5招募Bcl-xL蛋白,并调节Bcl-xL的稳定性。本实验的目的是研究INrf2是否参与糖尿病肾病,通过什么方式在其中起什么样的作用。我们第一次发现了INrf2在糖尿病肾病的大鼠模型中和高糖诱导人肾系膜细胞(HRMC)氧化损伤的过程中上调表达。上调表达的INrf2能够增加细胞的氧化压力并促进HRMC细胞的凋亡。我们发现INrf2是通过降解下调Nrf2蛋白和Bcl-2蛋白,促进氧化应激下细胞的凋亡,借此来参与糖尿病肾病的。目的：研究INrf2在糖尿病肾病中的表达水平,鉴定INrf2在肾小球细胞凋亡中作用,研究其参与糖尿病肾病的作用机制。方法：1.构建STZ诱导大鼠糖尿病肾病的动物模型和高糖诱导人肾系膜细胞凋亡的细胞模型,然后检测其中INrf2的表达。2.通过过表达INrf2和siRNA诱导的knockdown,改变INrf2的表达,然后通过检测DNA的片段化和检测caspase的水平,考察改变INrf2表达对细胞凋亡水平的影响。3.通过CM-DCFH-DA实验检测高糖诱导的活性氧水平。4.Nrf2的活性通过检测其蛋白水平,核转位和诱导靶基因的转录来考察。5.通过免疫共沉淀来检测INrf2和Nrf2、INrf2和Bcl-2以及Bcl-2和Bax之间的相互作用。结果：1.STZ能够成功的诱导大鼠糖尿病肾病,并且导致大鼠肾小球细胞的凋亡,在该模型中INrf2在肾小球中上调表达。2.高糖能够成功诱导人肾系膜细胞中活性氧的产生和细胞的凋亡,在该细胞模型中INrf2也上调表达。3.过表达INrf2促进高糖诱导的细胞凋亡,而反过来抑制INrf2能削弱高糖诱导的细胞凋亡。4.过表达INrf2导致Nrf2和Bcl-2水平的降低。5.INrf2抑制Nrf2的活化,并促进活性氧的生成；同时INrf2也促进Bcl-2的降解,并上调Bax的蛋白水平。结论：1.INrf2在糖尿病肾病模型中上调表达。2.INrf2增强高糖诱导的氧化压力,并导致细胞凋亡上升。3.INrf2在糖尿病肾病中抑制Nrf2的活化并促进活性氧的产生。4.INrf2在糖尿病肾病中促进Bcl-2的降解,并导致细胞凋亡的上升。