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研究目的：酒精性股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）发病率高。目前，酒精性ONFH早期病例采取保守治疗，晚期病例行人工髋关节置换术。但是，保守的疗法效果差，手术疗法有很多并发症。近年来的研究显示：在体外实验中酒精可以通过增加骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）内过氧化物酶体增殖子活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）基因的表达而诱导MSCs分化为脂肪细胞，使成骨分化减少，这与体内酒精中毒导致的股骨头内脂肪细胞增加、骨质疏松的病理改变一致。PPARγ是一种成脂转录因子，能够诱导脂肪前体细胞成熟为脂肪细胞，它在前脂肪细胞中不表达，而在脂肪分化过程中表达，并先于大多数脂肪基因的表达。没有PPARγ时，前脂肪细胞难以分化为脂肪细胞。在成脂作用和脂肪细胞分化中，PPARγ起着关键性调节作用。若MSCs内PPARγ表达，则其分化为脂肪细胞，抑制PPARγ活性可以抑制MSCs的脂肪分化，保持MSCs分化为成骨细胞。对酒精性ONFH的发病机制从基因水平给出了解释。目前RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术逐渐成熟，利用此技术有可能干扰或阻断酒精诱导MSCs内PPARγ基因的表达，从而抑制酒精诱导MSCs分化为脂肪细胞，保持其成骨分化，促进骨修复和重建，达到针对发病起始环节防治酒精性ONFH的目的。故本实验旨在观察采用RNAi技术阻断酒精诱导MSCs内PPARγ基因的表达的效果，为在发病起始环节防治酒精性ONFH提供可靠的科学依据。第一部分：针对PPARγsiRNA载体的构建和病毒包装方法：利用Takara、Ambion和promega siRNA靶序列分析设计系统，扫描兔PPARγ基因（AF013266），依据siRNA靶序列设计原则，BLAST分析与其他基因家族的同源性。最后确定3个编码序列是19个碱基的siRNA靶序列，同时随机组合出一条无关对照siRNA序列。分别合成4对编码短发卡RNA序列的DNA单链，两端分别加入BamHI和XhoI的酶切位点。将合成的4对发卡DNA分别退火，然后克隆入T载体pGEM-T；经过T7／SP6为引物的PCR扩增筛选，得到pGEM-T-siPPARγ-1、pGEM-T-siPPARγ-2、pGEM-T-siPPARγ-3和pGEM-T-C。BamHI和XhoI双酶切pGEM-T-siPPARγ-1、pGEM-T-siPPARγ-2、pGEM-T-siPPARγ-3、pGEM-T-C和siRNA载体pRNAT-U6.2／Lenti，分别回收双粘发卡DNA片段和线形化双粘siRNA载体；将4个双粘发卡DNA片段分别亚克隆入siRNA载体，通过BamHI／XhoI双酶切和PCR筛选、鉴定和DNA序列分析，得到质粒型siRNA表达载体pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-1，pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-2，pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-3，和pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-C。采用脂质体LipofectamineTM 2000包裹构建的siRNA表达载体和辅助包装载体，共转染293FT细胞，产生含有表达siRNA的Lentivirus病毒颗粒；最后对其进行纯化和病毒滴度测定。结果：1．PPARγsiRNA靶区段筛选：筛选得到针对兔PPARγ基因的3个siRNA靶序列，分别是GGCCTCCTTGATGAATAAA（677-695），GCAGGAGCAGAGCAAAGAA（497-515）和GGAAAGACGACAGACAAAT（402-420）。2．发卡DNA片段的克隆：PPARγ和对照发卡样siRNA单链DNA退火产物与pGEM-T Easy连接后，转化JM109，蓝白筛选后随机各选择10菌落以T7／SP6作为引物进行PCR扩增，都得到有为252bp扩增片段的阳性克隆。3．亚克隆入siRNA表达载体：连接pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-1、2、3和pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-C转化JM109，在Amp+LB平板上培养，都长出10个以上阳性菌落；利用pRNAT-U6.2／Lenti插入鉴定引物扩增鉴定，4种亚克隆重组子都有扩增片段为560bp的阳性克隆；分别提取重组质粒，用BamHI／XhoI双酶切对重组质粒进行鉴定，证实得到pRNAT-U6.2／Lenti-siPPAR-1、2、3和pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-C。对插入序列DNA测序结果与设计比较，完全一致。4．表达siRNA的Lentivirus病毒包装：亚克隆重组子与包装质粒共转染293FT细胞，得到滴度为2.1×107 IU／ml-4.3×107 IU／ml的表达siRNA的Lentivirus病毒颗粒。第二部分：siRNA阻断酒精诱导兔骨髓基质细胞内PPARγ表达的实验研究方法：选用新西兰白兔取骨髓，制备兔MSCs。实验共分7组，对照组（Normal，N）：单纯的MSCs；模型组（Model，M）：单纯酒精诱导；感染空载体组（Control 0，C0）：酒精诱导同时感染空载体pRNAT-U6.2／Lenti包装产生的Lentivirus病毒；感染无关siRNA组（Control 1，C1）：酒精诱导同时感染pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-C包装产生的Lentivirus病毒；干扰1、2、3组（siRNA1，S1、siRNA 2，S2、siRNA 3，S3．）：酒精诱导同时感染pRNAT-U6.2／Lenti-siPPARγ-1、2、3包装产生的Lentivirus病毒。第二代MSCs接种于6孔培养板（或培养瓶）中，每孔加入包装病毒，病毒量相当于每个MSCs感染10个包装病毒，感染12h，然后换完全高糖DMEM培养基，同时在需要酒精诱导的各组中加入酒精，酒精终浓度为0.09mol／L，进行诱导。在以后的培养中，换液时对需要酒精诱导的各组都加入酒精，酒精终浓度为0.09 mol／L。逐日用倒置显微镜观察MSCs的形态及生长情况。在酒精诱导3、5、7、14天时，均用荧光定量RT-PCR和Western-blot方法分别检测各组MSCs内PPARγmRNA表达水平和蛋白表达量。在酒精诱导14天时，对培养MSCs用苏丹Ⅲ染色，进行脂肪细胞计数；用相应试剂盒检测细胞的TG含量、MSCs骨钙素分泌量和细胞的ALP活性。所有实验数据以均数±标准差（（?）±S）表示，采用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准a=0.05。结果1．包装病毒感染观察：荧光显微镜观察可见，感染空载体组、感染无关siRNA组、干扰1组、干扰2组和干扰3组的MSCs细胞，几乎100％都可发出绿色荧光，而对照组和模型组未见任何荧光，显示包装病毒感染MSCs效率很高。2．荧光定量RT-PCR：模型组、感染空载体组、感染无关siRNA组在酒精诱导3天后PPARγmRNA表达量就迅速升高，持续酒精诱导下，一直保持高水平表达；对照组在14天的培养中，细胞内PPARγmRNA表达水平相对恒定，保持一个较低的水平；3个干预组都能够不同程度的抑制细胞PPARγmRNA的表达，其抑制效果干扰1组＞干扰3组＞干扰2组，抑制效果随时间的延续而逐渐减弱；至实验第14天，与模型组、感染空载体组和感染无关siRNA组比较，实验组siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组的PPARγmRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。3．Western-blot：酒精诱导3、5、7、14天，免疫印迹显示，对照组PPARγ蛋白印迹较浅，而模型组、感染空载体组和感染无关siRNA组PPARγ蛋白印迹较对照组深；干扰1组、干扰2组和干扰3组PPARγ蛋白印迹较对照组浅，表明包装siRNA病毒能够有效地抑制MSCs内PPARγ蛋白的表达水平。4．脂肪细胞数和TG含量：酒精诱导14天，与对照组比较，模型组、感染空载体组、感染无关siRNA组中脂肪细胞数多、细胞TG含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，干扰1组、干扰2组和干扰3组的脂肪细胞数接近、细胞内TG含量稍高，差异无统计学意义（P＞0.05）。5．骨钙素分泌和ALP活性：酒精诱导14天，与对照组比较，模型组、感染空载体组和感染无关siRNA组中细胞分泌骨钙素减少、细胞ALP活性减低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，干扰1组、干扰2组和干扰3组中细胞分泌骨钙素量接近、细胞ALP活性稍低，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1．成功构建3个靶向兔PPARγ基因的真核siRNA载体，通过体外包装，获得对MSCs具有高感染效率的siRNA病毒颗粒。2．构建siRNA病毒颗粒感染酒精诱导的MSCs，能有效地阻断MSCs中PPARγmRNA和蛋白水平的表达；感染一次，有效抑制时间至少可长达2周。3．采用RNAi技术阻断MSCs内PPARγ基因的表达，可抑制酒精诱导MSCs成脂分化，保持MSCs成骨分化。4．为酒精性股骨头坏死的基因防治提供了可靠的科学依据。