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研究背景与目的:随着社会与经济的不断发展,我国乳腺癌发病率在总体上已经接近全球女性乳腺癌的发病率,并且每年均呈现升高趋势,增长速度也在不断加快。三阴乳腺癌特指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体-2均为阴性的一种特殊类型的乳腺癌,由于它的细胞表面不存在特殊的细胞表面受体,因此,三阴乳腺癌具有侵袭力强,复发时间提前,远处转移发生率高,疾病进展迅速,治疗手段有限,疗效欠佳,无病生存率、总生存率较低,总的生存时间缩短等特点。如何提高其治疗缓解率,探索低毒高效的中药提取物或维生素制剂对该亚型乳腺癌的干预作用逐渐引起国内外学者们的重视。本课题首先通过回顾性分析既往使用姜黄素补充剂与维生素C注射液的晚期三阴乳腺癌患者,分析上述方法对该类人群的肿瘤大小与生存时间与的影响。然后,从细胞的层面,观察单独使用姜黄素、单独使用VitC、姜黄素与VitC联合使用(联合药物组)作用于人源性三阴乳腺癌MDA-MB-468细胞,是否具有抑制其生长的作用。最后,对其具体的作用机制进一步进行详细分析,为三阴乳腺癌低毒高效的辅助治疗提供新的理论基础。研究方法:研究一:回顾性研究既往8年在我院单独使用化疗药(对照组)和化疗药结合口服姜黄素补充剂与维生素C注射液(治疗组)的晚期三阴乳腺癌患者的病历70份,系统分析上述治疗方法对其肿瘤大小、肿瘤指标、功能状态评分、无疾病进展生存时间及总生存时间的影响。研究二:选择人源性三阴乳腺癌MDA-MB-468细胞株作为研究对象,通过姜黄素、VitC、联合用药组作用于该细胞株,采用CCK8法、流式技术以及transwell小室侵袭实验技术,观察各组药物对该细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡,及细胞侵袭力的影响。研究三:深入研究各组药物对该细胞株生长抑制作用的具体机制,观察不同药物组在两个时间点(24小时与48小时)对EGFR/Akt信号传导通路的影响。采用PCR及Western blot法,检测姜黄素、VitC、联合用药组对EGFR、Akt、p-Akt、P53、Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3、P27、MMP-2、MMP-9及VEGF表达的影响。研究结果:研究一:所有患者均可评价近期疗效,治疗组患者完全缓解(CR)2例,部分缓解(PR)15例,病情稳定(SD)13例,治疗有效率为49%,临床获益率为86%。对照组患者无CR病例,PR14例,SD14例,治疗有效率为40%,临床获益率为80%,与治疗组相比,治疗有效率(Response rate,RR)及临床获益率(Clinical benefit rate,CBR)均无显著性差异(P>0.05)。治疗组患者中位无疾病进展生存时间为7个月(1.5~28.5个月),中位总生存时间为27个月(4~40个月)。对照组患者中位无疾病进展生存时间为4.5个月(1.5~8个月),中位总生存时间为18个月(3~26个月)。治疗组在无疾病进展生存时间以及总生存时间,相比对照组,均显著延长(P<0.05)。两组患者在接受吉西他滨联合顺铂的化疗方案,不良反应主要集中在消化道反应与骨髓抑制。治疗组相比对照组,不良反应发生率显著降低(P<0.05)。研究二:1.本研究证实姜黄素、VitC、联合用药组对人源性三阴乳腺癌MDA-MB-468细胞具有抑制其增殖、侵袭,并诱导凋亡的作用。相比对照组,在单独使用姜黄素组,单独使用VitC组,联合组这三组药物不同浓度下,对MDA-MB-468细胞均具有抑制作用。随着各组药物浓度增加,其抑制作用越强。其中,联合组50+20的抑制作用最强(P<0.05)。2.在联合用药组50+20的作用下,MDA-MB-468细胞在G1期分布较多,S期比例下降。相比对照组,三组药物均具有抑制细胞体外侵袭能力的作用。三组药物抑制细胞体外侵袭作用的强弱顺序为:联合组>姜黄素组>VitC组,差异有统计学意义(P<0.05),随着药物浓度增加,穿过基底膜的细胞数越少(P<0.05)。研究三:各组药物通过调节EGFR/Akt信号传导通路,达到抑制MDA-MB-468细胞增殖的作用。1.相比对照组,各组药物在24小时及48小时对EGFR的表达均显著抑制(P<0.05)。联合组50+20作用于MDA-MB-468细胞48小时,显著抑制EGFR的表达,作用优于其它组(P<0.05)。2.相比对照组,各组在24小时及48小时对P-Akt、Bcl-2的表达均显著抑制(P<0.05),与Ly294002药物的作用一致。联合组50+20,作用于MDA-MB-468细胞48小时,显著抑制P-Akt、Bcl-2的表达,作用优于其它组(P<0.05),差异有统计学意义。相比对照组,各组在24小时及48小时,显著增加P53、Bax、Caspase-3、Caspas-9、P27的表达(P<0.05),与Ly294002药物的作用一致。联合组50+20,作用于MDA-MB-468细胞48小时,显著增加上述蛋白酶的表达,作用优于其它组(P<0.05)。3.三组药物对MDA-MB-468细胞株MMP-2、MMP-9表达的影响:相比对照组,各组药物在24h及48h均对MMP-2的表达显著抑制,联合药物组在48小时对MMP-2的表达抑制作用最强。对比三组药物对MMP-2蛋白表达抑制作用的强弱顺序为:联合组>VitC组与姜黄素组,随着各组药物的浓度增加,蛋白表达水平逐渐降低。此外,联合组还具有抑制MMP-9表达的作用。然而,单独使用姜黄素组及单独使用VItC组均没有此作用。4.相比对照组,各组药物在24h及48h对VEGF的表达均显著抑制(P<0.05)。对比三组药物对VEGF表达抑制作用的强弱顺序为:联合组>VitC组与姜黄素组,随着各组药物的浓度增加,蛋白表达水平逐渐降低。结论:1.回顾性病例研究显示,治疗组相比对照组,虽然在近期治疗有效率方面并无显著的差异;但是,治疗组的功能状态评分在治疗后显著高于治疗前,且显著高于对照组(P<0.05)。治疗组相比对照组,显著延长无疾病进展生存时间与总生存时间(P<0.05)。而且,治疗组的不良反应发生率显著低于对照组(P<0.05)。本研究结果提示姜黄素补充剂结合维生素C静脉输注治疗,在化疗期间使用,有助减轻化疗药物带来的不良反应,使患者更耐受治疗,顺利完成化疗的疗程。而且,有助延长晚期三阴乳腺癌患者无疾病进展生存时间与总生存时间。2.本研究证实姜黄素、VitC及联合用药组均具有抑制人源性三阴乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖作用,随着各组药物浓度增加,其抑制作用越强。其中,联合组50+20的作用优于其他药物浓度(P<0.05)。在联合用药组的作用下,MDA-MB-468细胞在G1期分布较多,S期比例下降。相比对照组,三组药物均具有抑制细胞体外侵袭能力的作用:联合组>姜黄素组>VitC组,差异有统计学意义(P<0.05),随着药物浓度增加,穿过基底膜的细胞数越少(P<0.05)。从时间点上看,各组在48h的作用比24h强。3.本研究还证实姜黄素、VitC及联合用药组对MDA-MB-468细胞的生长抑制作用是通过调节EGFR/PI3K/Akt细胞信号传导通路实现的。其中,联合组50+20相比单药组,调节作用是最强的,其在48h的作用显著优于24h(P<0.05)。各组药物通过调控该信号传导通路中的个别基因与下游靶蛋白的水平,参与调控细胞凋亡、细胞周期、侵袭与转移、新生血管的生成。具体作用机制如下:通过抑制EGFR的表达,降低p-Akt的水平,继而上调p53基因的表达,抑制Bcl-2的水平。p-Akt被抑制,直接激活Bax的表达,最终令Bcl-2与Bax的比值降低,促进下游蛋白caspase-9和caspase-3表达的上调,启动细胞程序性凋亡的发生。再者,p-Akt被抑制,上调P27水平,使细胞阻滞于G1期,无法进入S期,最终使细胞增殖受到抑制,凋亡增加。此外,姜黄素联合VitC通过下调MMP-2、MMP-9及VEGF的表达,抑制MDA-MB-468细胞的侵袭与转移能力,并抑制肿瘤新生血管的形成(图4-7)。