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国家I级保护野生动物、珍稀濒危物种——鳄蜥(Shinisaurus crocodilurus Ahl,1930)正面临严峻的生存问题,包括种群数量快速下降、生境地遭受破坏导致片段化、疾病起源与治疗方案未知等多重问题。物种长期生存,依赖于内在基因的遗传多样性,特别是免疫基因的遗传多样性对物种抵御环境变化、病原体侵袭至关重要,了解鳄蜥免疫基因多样性有助于评估其长期生存能力、对野外自然环境病原体的抗性,对人工繁育管理、野外放归策略的制定具有重大的指导意义。在免疫基因中,先天性TLR4(Toll-like receptor 4)基因已经被证明对爬行类物种的免疫具有重要功能,MHC(Major histocompatibility complex)基因则在大多数脊椎动物中均有分布且研究广泛,在爬行动物的免疫系统中与其他哺乳类具有同等重要的功能。有研究资料表明,TLR受体对MHC受体的表达具有调控作用,这两个基因可以为研究鳄蜥复杂的免疫系统提供基础资料。因此,为了解鳄蜥免疫基因遗传多样性程度,本文选取MHC基因与TLR4基因,利用PCR扩增与测序及生物信息学分析方法,对国内广西大桂山、广西大瑶山、广东罗坑、广东林州顶种群鳄蜥及越南种群鳄蜥的5个地理种群进行研究,主要结果如下:(1)鳄蜥基因组共有16个MHCI基因,5个MHCIIβ基因。根据鳄蜥MHCI基因外显子数量与结构、MHC复合体氨基酸的保守位点分析和氨基酸同源性分析,确定扩增的636D7、893D1和893D9基因属于经典的MHCI基因,排除假基因的可能。MHCIIβ基因数量较少,由于898D1、898D4基因的外显子数量与基因结构具有正常MHCII基因的结构,因此选取用于实验扩增。(2)MHCI基因中893D9的外显子2扩增数量为20条,包括广西、广东、越南鳄蜥各4条,发现在长205bp的序列中未发现任何碱基位点的变异,636D7基因的外显子3扩增数量为20条,各种群包括4条,发现长180bp的序列中仅有一个碱基位点的变异。MHCIIβ基因中898D4、898D1的外显子2最终分析序列分别187bp和188bp,898D4外显子2具有3个碱基变异位点,但898D1外显子2则未发现变异位点。898D1外显子3长194bp的最终序列,未发现任何变异位点。(3)MHCI基因中893D1外显子2最终获得的序列长203bp,实验扩增鳄蜥中发现一只广西大桂山个体(a2)具有24个碱基变异位点,排除该个体进行扩增序列比对后发现仅1个变异位点。对该个体进行再次独立扩增和测序、峰图检验等,证实该个体确实存在变异。这是一只稀有的在MHC基因上具有多态性的鳄蜥个体。(4)TLR4基因最终获得的序列长度为1694bp,遗传多样性在各鳄蜥种群之间具有差异性,但核苷酸多样性指数差异不显著。单倍型数量、变异位点数、单倍型多样性指数指标之间具有较大差异性,在种群间有明显区别。单倍型数量最高为10个(广东林州顶种群),最低为6个(广东罗坑、广西大桂山、越南种群)。变异位点数最高达16个(广东林州顶种群),最低为9个(广西大瑶山种群)。所有种群的Tajima’D统计值显著大于0,偏离中性选择,表示鳄蜥可能经历瓶颈效应。(5)TLR4基因中,所有个体共存在27个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,SNPs在种群间分布具有地理特异性,12个SNPs仅出现在一个特定种群,但广西大桂山、广西大瑶山不具种群独有SNP。4个SNPs分布在所有种群,其余11个分布2至3个种群不等。同样具有地理分布特异性的还有单倍型,31个单倍型中仅有3个单倍型在种群间共有(H02、H03、H16),其余单倍型仅分布单个种群。(6)TLR4基因27个SNPs位点导致9个氨基酸改变,3个氨基酸改变影响TLR4受体蛋白的结构和功能,苏氨酸变为赖氨酸(Thr>Lys)、组氨酸变为亮氨酸(His>Leu)处在识别病原体关键位置的亮氨酸重复富集区域(leucine-rich repeats,LRRs)内,缬氨酸变为蛋氨酸(Val>Met)处于信号传导的跨膜结构区域。2个影响TLR4受体结构与功能的氨基酸替换位点处于蛋白质结构的内侧。结果表明鳄蜥基于MHC蛋白结合的病原体种类较单一,抵抗病原体入侵的能力较弱。种群中仍有少量鳄蜥维持部分MHC基因位点的多态性,物种水平上仍有希望通过这些仅存的个体通过强力的人工繁殖干预将变异位点遗传至下一代,从而维持整个鳄蜥基因库保留一定的遗传多样性。TLR4基因的单核苷酸多态性(SNP)位点和单倍型在种群间具有分布特异性的特点,说明鳄蜥在不同的地理位置可能遭受不同病原体压力,这种选择压力促使基因往不同的方向发生变异。在鳄蜥的TLR4基因的碱基位点突变会产生部分有害氨基酸,后续应关注鳄蜥个体健康与TLR4基因的点突变是否具有联系。虽然以MHC基因丰富度为人工繁殖策略的目标具有争议,但鉴于鳄蜥MHC基因几乎完全丧失变异的情况,仍建议通过分子生物学技术对鳄蜥大规模筛选MHC基因具有一定变异的个体,通过人工干预与其他丧失变异的个体进行交配,有效遗传变异位点。此外,保护区之间应该共享鳄蜥的疾病信息、治疗方案等,TLR4基因的SNP以及单倍型在种群间共享证明有些病原体在不同种群间是共有的,可能引起相同的疾病,信息交流可以有效促进全面的鳄蜥保护工作。