研究背景:随着现代医学的发展进步,组织和器官移植己经成为治疗多种疾病的重要措施,如异体皮肤移植,是救治大面积深度烧伤、严重创伤的关键措施之一。如何延长异体移植物的存活时间和降低其免疫原性,是在临床应用中面临的重要难题。目前各种新型免疫抑制剂虽然延长了移植物存活时间,改善了移植术后的排斥反应。但长期、大剂量使用免疫抑制剂常导致骨髓抑制、糖代谢紊乱等问题,造成机体对感染和肿瘤的抵抗能力降低,从而引起急性感染甚至癌症,显著影响受者的生活质量。因此,我们需要寻找一种能够诱导异体移植免疫耐受、延长移植物存活时间且毒副作用小、安全系数高的方法。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种存在于骨髓、脂肪、脐带和牙髓等多种组织的成体干细胞,与骨髓等来源的干细胞相比,人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）来源丰富,可以通过无创性常规临床操作从脱落的乳牙、智齿、正畸牙中获取,具有易于获得、伦理问题较少等优势。而且,研究发现其具有低免疫原性和较强的免疫调节功能等优点,对于其在抗自身免疫反应等相关领域的应用具有广泛的潜能。目前,有文献报道通过预先调节MSCs的环境或通过药理学刺激改变其旁分泌的能力,从而增强其免疫调节能力,可以进一步提高其治疗效果。研究报道对MSCs进行低氧预处理,有助于其干性的维持,增加其相关细胞因子的分泌,以增强其生物学功能,例如免疫调节能力,促血管生成能力等。作为铁离子螯合剂,去铁胺（deferoxamine,DFO）处理细胞可以模拟细胞的低氧状态。另有研究表明,MSCs免疫抑制能力需要炎性因子的诱导,包括干扰素-γ（IFN-γ）在内多种炎性因子均可调控MSCs的免疫调节功能。然而,去铁胺（deferoxamine,DFO）联合干扰素-γ（IFN-γ）对间充质干细胞的生物学功能,特别是对其免疫调节能力的影响还未见报道。研究目的:本实验拟分别通过体外和体内实验,研究DFO和IFN-γ联合作用对hDPSCs生物学功能和免疫调节能力的影响,对动物同种异体移植皮肤的存活影响,评价这种处理方式是否可以增强其生物学功能和免疫抑制能力,诱导免疫耐受,以期为hDPSCs用于皮肤移植,或其它组织器官移植的临床治疗提供新的思路和方法。研究内容:第一部分:DFO和IFN-γ对hDPSCs的生物学功能和免疫调节能力的影响选取人牙髓间充质干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）为研究对象,实验分为4组:hDPSCs组,DFO预处理的hDPSCs组,IFN-γ预处理的hDPSCs组,以及DFO联合IFN-γ预处理的hDPSCs组。取培养至第5/6代的hDPSCs接种到96孔板,培养过夜后,实验组细胞培养上清中分别加入DFO、IFN-γ或DFO联合IFN-γ作用1,2,3,4,5天,用cck8试剂盒检测细胞的增殖情况。培养至第5/6代的hDPSCs接种到6孔板,培养过夜后,实验组细胞上清中分别添加DFO、IFN-γ或DFO联合IFN-γ作用48h,用ELISA法检测细胞培养上清中相关炎性因子TGF-β1、IDO、PGE2和IL-6的含量;另用Trizol法提取细胞总RNA,通过Q-PCR法检测hDPSCs相关基因VEGF、IL-6、HGF、IDO、TGF-β1、COX-2、IL-4、IL-10、TSG-6和HLA-G的m RNA表达变化。取培养至第5/6代的hDPSCs接种到96孔板,培养过夜后,实验组细胞培养上清中分别加入DFO、IFN-γ或DFO联合IFN-γ作用48h,分离C57BL/6小鼠脾淋巴细胞,用CFSE进行荧光标记,按5:1的细胞比例加入到各组hDPSCs培养体系中共培养,通过流式细胞仪分析CFSE荧光的改变来计算脾淋巴细胞的增殖,并通过流式细胞术检测共培养后调节性T细胞（Treg）的比例变化。细胞增殖实验结果显示,DFO和IFN-γ预处理都抑制了hDPSCs细胞生长,DFO作用更为明显;Q-PCR测定的结果显示,DFO处理明显增加了VEGF、TGF-β1、COX-2、IL-4和IL-10的表达,而IFN-γ处理明显增加了HGF和IL-6的表达,而联合预处理明显提高免疫抑制相关基因TGF-β1、COX-2、HLA-G和TSG-6的m RNA表达水平,此外还明显提高了VEGF和HGF的表达;ELISA检测结果表明,进一步证明联合预处理可以增强hDPSCs分泌炎性因子IL-6、TGF-β1和PGE2;此外,联合预处理显著增强了hDPSCs抑制淋巴细胞增殖的作用。第二部分:DFO联合IFN-γ预处理hDPSCs对小鼠异种皮肤移植的作用通过将BALB/c小鼠背部的皮肤移植到CBL57/6小鼠的背部皮肤缺损处,建立小鼠异体皮肤移植模型。建模成功后,将30只C57BL/6小鼠随机分为以下3组,每组10只:PBS组（空白对照组）、hDPSCs组（单纯干细胞治疗组）和DFO+IFN-γ-hDPSCs（DFO联合IFN-γ预处理hDPSCs组）。术后小鼠立即经尾静脉注射PBS或不同预处理的hDPSCs,实验观察2周。术后记录移植皮肤存活时间,进行移植物大体观察、组织病理学分析、免疫组化与免疫荧光分析,流式细胞术分析受体小鼠脾Treg细胞的比例,CBA流式多因子技术来分析受体小鼠外周血Th1/Th2/Th17相关因子的分泌变化。皮肤移植存活时间结果显示,hDPSCs可以延长小鼠异体移植皮肤的存活时间,而经过DFO联合IFN-γ预处理过的hDPSCs延长存活时间更为显著。移植皮片的大体外观观察及病理学观察结果表明,hDPSCs可以明显减轻动物对移植皮片免疫排斥反应,同时,DFO联合IFN-γ预处理的hDPSCs对移植皮片免疫排斥的抑制作用更为明显。免疫组化结果显示,对照组小鼠移植皮片中存在大量与排斥反应相关的CD4+T,CD8+T以及巨噬细胞浸润,而hDPSCs注射组（单纯干细胞治疗组）上述细胞的浸润有所减轻,DFO+IFN-γ-hDPSCs（DFO联合IFN-γ预处理hDPSCs组）上述免疫细胞浸润最少,说明DFO联合IFN-γ预处理促进了hDPSCs对上述免疫细胞浸润的抑制,减轻了免疫排斥反应。hDPSCs促进了受体小鼠脾Treg细胞比例的增加,DFO联合IFN-γ预处理的hDPSCs促进受体小鼠脾Treg细胞比例的增加更为显著。DFO联合IFN-γ预处理hDPSCs促进了受体小鼠外周血中炎性因子IFN-γ、IL-2、TNF-a、IL-6、IL-17、IL-10和IL-4等分泌增加。研究结论:DFO联合IFN-γ预处理增强了hDPSCs的免疫调节作用,表现为抑制免疫反应的蛋白和细胞因子表达增多,对淋巴细胞的抑制作用增加,延长了小鼠异体移植皮肤的存活时间,减轻了免疫排斥反应。