论文部分内容阅读
MNNG作为一种单功能烷化剂,被认为是环境中广泛存在的化学致癌物。其可以导致DNA断裂、基因突变甚至肿瘤的发生。MNNG诱导的DNA损伤反应可以激活许多修复相关基因。核糖核苷酸还原酶(RNR)催化核糖核苷二磷酸还原为脱氧核糖核苷二磷酸,在DNA合成和修复过程中起重要作用。人核糖核苷酸还原酶由两个相同的大亚基(RRM1)和两个相同的小亚基(RRM2或p53R2)组成两种RR酶,即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可以影响细胞中RRM2或p53R2的表达水平,以及通过何种途径影响至今没有相关报道。本文研究了MNNG诱导RRM2和p53R2转录上调的作用和机制。(1)我们发现MNNG可以通过转录调控途径诱导RRM2和p53R2基因表达上调,但不影响RRM1的表达水平。而且,MNNG不仅可以诱导RRM2/p53R2的转录上调,同时也导致了它们的核转位。(2)通过检测MNNG处理前后P-H2AX水平,细胞周期分布及细胞凋亡比例,我们发现RRM2主要参与MNNG诱导的DNA损伤修复过程,而p53R2的作用相对较弱。(3)通过DNA pull-down偶联LC-MS/MS筛选、以及ChIP-qPCR和免疫印迹法验证,我们发现MNNG处理KB细胞后,转录因子E2F3、E2F1及NFY结合到RRM2启动子。结合位点邻近于E2F结合序列的NFY可以加强E2F3和E2F1结合到RRM2启动子上。通过使用免疫共沉淀技术分析发现NFY与E2F3在细胞内存在相互作用。报告基因实验结果显示相较于E2F1,E2F3可以显著激活RRM2的启动子报告基因活性。在KB细胞系中,过表达E2F3能够增加RRM2的表达,从而降低MNNG诱导的p-H2AX水平。通过小RNA干扰E2F3可以有效抑制MNNG诱导的RRM2表达上调,进而增强p-H2AX水平。(4)有趣的是,MNNG主要通过翻译后修饰导致E2F3水平上调。同时,我们也发现MNNG可以快速诱导NFYA和NFYB mRNA水平的上调。上调的NFY入核与E2F3联合调控RRM2的转录。(5)为了进一步探究E2F3表达上调的分子机制,我们研究了E2F3上游可能的信号激酶。结果显示MNNG是通过激活ATR-CHK1-E2F3信号通路上调E2F3蛋白水平,从而转录激活RRM2基因,参与DNA修复。对于p53R2,我们发现MNNG诱导其转录上调不仅依赖于p53,同时也依赖于E2F1。而MNNG诱导的RRM2转录上调主要依赖于E2F3和NFY。综上所述,本文结果表明RNR参与化学致癌物MNNG诱导的DNA损伤修复,该作用对细胞维持基因组稳定性至关重要；更重要的是,我们发现转录因子E2F3和NFY及其上游信号通路调控RRM2在MNNG诱导的DNA损伤修复过程中起重要作用；而RNR表达调控机制的异常可能与环境化学物质的致突变致癌作用机制相关。