肝脏由于受到病毒、酒精、脂肪等因素刺激造成慢性肝脏损伤,在其愈合的过程中出现结缔组织的异常增生,从而导致肝纤维化的形成。肝纤维化是慢性肝病恶化为肝硬化的中间病理过程,也可以通过消除致病因素实现逆纤维化恢复健康。肝纤维化的发生发展过程及其潜在的分子机制对于治愈肝脏疾病有着重要的研究价值。研究表明,肝纤维化的发生是多种细胞和细胞因子共同作用的结果,其中最关键的一步是肝星形细胞（HSC）的激活。因此,从肝脏中去除或灭活活化的HSCs可能是肝脏从肝纤维化中恢复的一个重要手段。Kazal Ⅰ型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor Kazal-type Ⅰ,SPINK1）最初是从胰腺中发现的蛋白酶活性调节因子。其空间结构与表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）类似,可以同EGF的受体（EGFR）结合进而调控细胞增殖、参与炎症反应和肿瘤的发生与发展。另外,SPINK1在多种肝病模型中均发生高表达,本实验室前期采用大鼠全基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的基因表达谱,发现Spink1在造模3w、6w、9w的表达均显著上调。然而,SPINK1对肝纤维化的调节作用及机制研究尚未见报。因此,本课题拟探究SPINK1对肝纤维化过程中的关键细胞HSC-T6的调节作用及其机制。本课题通过构建CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,采用HE染色和肝功能指标进行鉴定。用免疫组化法检测病理切片,结果显示,与对照组相比,α-SMA和SPINK1含量发生了高表达。另外,在体外用TGF-β1诱导HSC-T6活化的细胞模型中发现,SPINK1和α-SMA表达水平升高,推测SPINK1可能与HSC-T6的活化及肝纤维化相关。为进一步探究SPINK1对肝星形细胞HSC-T6生物学行为的影响,本文采用基因添加和用重组蛋白处理的方法使HSC-T6细胞中的内源性和外源性SPINK1均过表达,采用MTT、EdU和PI单染色法、伤口愈合实验分别检测其对HSC-T6细胞的活力、增殖能力、细胞周期和迁移能力的影响。通过qRT-PCR和Western blot检测相关基因和蛋白的表达情况,推测SPINK1调控HSC-T6细胞的可能机理。结果表明,通过基因添加和用重组蛋白处理提高内源性和外源性SPINK1水平后,HSC-T6细胞的细胞活力、增殖能力、细胞周期、迁移能力均显著提高。而PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路中的蛋白磷酸化,表明SPINK1可能通过这两条信号通路调控星形细胞增殖的。另外,HSC-T6细胞活化的标志蛋白α-SMA和COL1A1均发生高表达,TGF-β信号通路中的蛋白磷酸化,推测SPINK1可能是通过TGF-β信号通路调控HSC-T6的细胞活化,为进一步证实SPINK1通过TGF-β信号通路调节HSC-T6的细胞活化,本文又通过添加TGF-β信号通路抑制剂SB431542的方法验证了以上结论。