目的：分离培养人牙周膜内Malassez上皮剩余细胞,探讨一种简便、原代培养成功率高、可重复性好的细胞培养方法,为进一步在体外研究Malassez上皮剩余细胞的生物学特性及功能提供实验条件。方法：选取12～25岁青少年因正畸拔除的前磨牙,采用组织块培养法和酶消化法进行牙周膜细胞原代培养。先使用含血清的DMEM培养液培养,当细胞融合达50%左右时,对Malassez上皮剩余细胞进行选择性培养,按比例逐渐减少培养液中血清含量,同时增加细胞生长所需的因子,直到完全使用无血清培养基。采用形态学观察、免疫组化方法鉴定其来源,并绘制生长曲线。结果：(1)分离下的牙周膜,在经过初期含血清培养基的组织块培养后,5-16天可见组织块周围有细胞爬出,大部分是成纤维细胞,细胞形态呈长梭形,其间有部分多角形或“铺路石”样细胞,为上皮细胞,胞浆均匀,轮廓清晰。(2)酶消化法培养的牙周膜细胞,在12小时后即有细胞的贴壁变形,2-3天后大部分细胞贴壁生长,所得细胞大部分也是成纤维细胞,含少量上皮细胞,成纤维细胞和上皮细胞的形态学特征与组织块法培养的相似。(3)经过12-24天牙周膜细胞原代培养,细胞融合可达50%左右,加入无血清培养基后,可见成纤维细胞的生长受到明显抑制,其数量逐渐减少,而上皮细胞在适应无血清环境后数量逐渐增加。(4)经波形丝蛋白、细胞角蛋白AE1/AE3及CK14免疫组化染色鉴定,原代培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂,符合人牙周膜上皮细胞的形态学特征和生物学特性。结论：(1)采用组织块法和酶消化法进行牙周膜细胞的原代培养,均获得了一定的成功率。两种方法皆为牙周膜细胞原代培养的可靠方法。(2)采用无血清培养基进行Malassez上皮剩余细胞的体外培养,可以成功地培养出实验用细胞,并作为体外细胞模型,此方法简单易行,可重复性高,为进一步研究其功能奠定基础。