研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)已成为导致老年人残疾的第一大疾病,该病临床症状主要为关节剧烈的疼痛和功能障碍。目前对OA采取的抗炎、止痛等治疗方法都无法改变病程,效果有限。OA之所以缺乏有效治疗措施,主要原因在于其复杂发病机制不明确。其中血管侵入软骨破坏关节骨软骨之间的屏障,加重炎症反应,是导致临床症状和病情进展的重要因素。但目前对OA软骨内血管生成与OA退变程度的关系并不明确。正常软骨内无血管,这是促血管生成因子和抗血管生成因子之间平衡的结果。OA软骨内长入血管主要由于这种平衡被打破。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对血管生成的有较强的促进作用,是其中重要因子。OA软骨的表层、中层及深层中VEGF表达都被上调,而血管长入主要发生在深层软骨,这和该区域抗血管生成因子表达减弱有关。这提示OA软骨内抗血管生成因子下降是导致血管长入的重要原因。软骨调解素-I(chondromodulin-I,ChM-I)是一种软骨内生性,具有抗血管生成和促软骨细胞增殖作用的糖蛋白,能抑制血管内皮细胞的增殖及VEGF诱导的细胞骨架和伪足伸展,从而影响血管内皮细胞趋化迁移及小管样细胞网络形成。ChM-I在正常软骨中大量表达,是维持软骨组织无血管状态的重要因素。OA动物模型中ChM-I的表达下调,是导致OA软骨钙化层内血管生成的重要原因。目前OA患者软骨内ChM-I表达的情况,与软骨内血管生成的关系及其调控机制不清楚。阴阳1(yinyang1,YY1)锌指类转录因子GL1-Krüppl家族中的一员,广泛地存在于人、鼠、非洲爪蟾中,对基因转录具有促进或抑制的双重作用。多种肿瘤组织和鼻息肉中YY1表达上调,促进血管生成。最近有研究对OA中转录因子进行微阵列数据分析,结果提示转录因子YY1是OA调节网络中的重要转录因子之一,且与OA的始发有关。白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)可提高心肌细胞中YY1的丰度和活性。IL-1β也是OA软骨中主要的炎症因子,OA软骨中YY1的水平是否被上调,其在OA软骨中表达情况及其作用机制不明确。YY1可与ChM-I启动子结合抑制其表达。YY1/ChM-I信号通路可调节骨髓间充质干细胞和正常软骨细胞中ChM-I表达,该信号通路是否参与了OA软骨内血管长入的调控尚不清楚。目的综上所述,我们提出实验假设:炎症因子(IL-1β)上调OA软骨细胞中的YY1表达,YY1与ChM-I基因启动区的结合,导致ChM-I表达下调,从而减弱了软骨的抗血管生成能力,软骨下骨血管向软骨内长入。本实验将从人体组织病理学和体外细胞学两个水平验证以上实验假设。研究内容和方法1.观察OA患者关节软骨中血管生成、ChM-I、YY1表达变化情况及其相互关系。我们收集OA患者膝关节软骨组织标本。对标本进行病理切片、HE染色、固绿/番红O染色、评级;2.针对ChM-I、YY1进行免疫组化染色,收集软骨标本提取总RNA和蛋白,以实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot的方法检测OA患者关节软骨组织ChM-I、YY1的表达量变化;3.从获得的正常人的软骨组织中提取原代细胞进行体外培养,行甲苯胺蓝、II型胶原鉴定。以IL-1β刺激人软骨细胞,以RT-qPCR和Western blot的方法检测人软骨细胞ChM-I、YY1表达量的变化;4.以YY1的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)转染人软骨细胞,观察YY1基因干扰对IL-1β诱导的ChM-I、YY1表达变化的影响;5.最后提取各实验组的条件培养基处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),观察HUVEC的增殖、迁移、侵袭和成小管能力变化。结果1.软骨内血管生成与退变的关系:OA软骨内血管生成主要发生在软骨钙化层。软骨钙化层的形态变化(厚度、潮线、粘合线、软骨细胞数量)和软骨内长入的血管面积相关;2.ChM-I在OA软骨内的表达:轻度退变软骨中,ChM-I在表层软骨细胞的细胞质中的免疫染色强度明显下降。中间层ChM-I的染色强度减弱。在深层区域,ChM-I免疫染色减少。ChM-I的蛋白和mRNA的量较正常软骨下降。中度退变软骨中,ChM-I在表层软骨细胞的细胞质和细胞外基质中的免疫染色都下降。中间区域,ChM-I免疫染色强度比轻度退变软骨中的增强。在深层区域,ChM-I免疫染色明显下降。ChM-I的蛋白水平和mRNA表达量较轻度退变软骨的减少。重度退变软骨中,所有区域细胞外基质的ChM-I蛋白免疫染色均明显减弱。ChM-I免疫染色主要出现在簇样增生细胞群的细胞外基质中。ChM-I的mRNA表达量与中度退变软骨的无明显变化。YY1在OA软骨内的表达:轻度退变软骨中,YY1在表层软骨中的免疫染色强度增加。在中间区域,YY1的免疫染色强度轻度增强。在深层区域,YY1的免疫染色强度增强。YY1的蛋白和mRNA的量较正常软骨升高。中度退变软骨中,YY1的免疫染色强于轻度退变软骨的表层区域。中间区域,YY1的免疫染色强度增强。在深层区域,YY1的免疫染色强度较轻度退变时增强。YY1的蛋白和mRNA的量较轻度退变软骨升高。重度退变软中,YY1在关节面侧的细胞簇中免疫染色强度明显升高,深层区域中YY1免疫染色强度明显下降。YY1的蛋白和mRNA的量较中度退变软骨无明显升高。ChM-I、YY1与血管生成的关系:血管生成与细胞外基质中ChM-I免疫染色强度相关而和软骨细胞内ChM-I免疫染色强度及mRNA水平无关。血管生成与细胞外基质中YY1免疫染色强度及mRNA水平相关。3.体外培养人软骨细胞可维持软骨细胞表型,甲苯胺蓝、II型胶原阳性。IL-1β对ChM-I的表达具有下调作用,同时与IL-1β的刺激浓度、时间相关。IL-1β刺激软骨细胞后YY1有显著的升高,YY1表达的下调与IL-1β浓度、时间有关。4.YY1 shRNA对人软骨细胞的转染效率为91%,YY1的mRNA和蛋白下调率63%和61%。抑制软骨细胞YY1表达,再以IL-1β刺激人软骨细胞,发现原本在IL-1β刺激后下调的ChM-I表达有明显回升,提示转录因子YY1参与了IL-1β下调ChM-I的过程。这与文献报道的YY1可直接结合于ChM-I转录子启动区并抑制ChM-I的转录相符。5.IL-1β刺激正常人软骨细胞后条件培养基能明显抑制HUVEC增殖、缩小划痕宽度,减少侵袭的细胞数量及管样形成的数量;而YY1 shRNA干扰可使以上实验结果出现相反的变化。实验结果提示,IL-1β作用下的人软骨细胞可明显促进HUVEC细胞体外增殖、迁移、侵袭和成小管的能力,而YY1 shRNA能抑制这些能力。讨论本实验研究发现OA软骨内血管生成主要发生在钙化层,钙化层的厚度、潮线和粘合线的粗糙度,钙化层中软骨细胞的数量及血管通道的面积都与退变程度相关。钙化层随退变程度增加而增厚,而且发现2级退变时钙化层的厚度较1级退变是变薄的,提示在不同的退变阶段钙化层的形态变化是受到了不同的刺激因素而发生的。一方面,软骨下骨通过成骨反应使钙化层变薄。我们发现粘合线的粗糙度随退变程度加重而增加,这和软骨下骨的厚度密切相关,而且围绕血管通道成骨形成骨袖。另一方面,软骨下骨通过渗透作用是钙化层增厚。我们的研究显示不同退变程度软骨中血管的面积对钙化层有更大的影响。这两方面的影响都与血管长入有关。本实验发现ChM-I在正常软骨中是高表达,提示ChM-I在维持正常软骨无血管环境可能有重要意义。另外,我们发现OA软骨钙化层内长入血管随退变程度逐渐增大,而细胞外基质中ChM-I的表达水平下降。这提示在OA的病程中ChM-I蛋白的下降可能降低了软骨抑制血管长入的能力。我们的结果提示OA不同阶段ChM-I下降原因可能不同。在OA早期,ChM-I表达下降可能与软骨的纤维化有关。因为轻度退变OA软骨表面纤维化,同时ChM-I在这一区域的表达下降。在中重度退变软骨中,有更多的软骨细胞克隆。中间区域克隆软骨细胞的细胞质中ChM-I表达升高。ChM-I mRNA的水平也同样上调。在中重度退变软骨中,虽然中间区域的ChM-I表达上调,但所有区域ChM-I的整体表达却是下降的。因此,我们猜测OA晚期软骨中ChM-I下降可能与其降解消耗有关。本实验首次显示了YY1在OA软骨中的表达情况。在正常软骨组织可检测到YY1的表达,OA软骨中细胞出现增殖,YY1的表达上调。这可能与YYl促进细胞增殖有关。另外,本实验显示在重度OA的深层软骨中没有YY1表达,这可能与重度退变软骨深层的细胞已经凋亡有关系。OA患者软骨中YY1的表达与ChM-I的表达和血管长入有相关性,这种相关性在体外实验中得到了进一步验证。体外实验发现人软骨细胞被IL-1β刺激后产生的条件培养基能促进HUVEC细胞的增殖、迁移、侵袭和小管形成。这可能与ChM-I降低有关,因为本实验发现IL-1β刺激人软骨细胞后可导致ChM-I表达下降。而IL-1β导致的ChM-I下降可能是由YY1介导的。实验发现,人软骨细胞在IL-1β刺激,YY1的表达上调,与ChM-I的变化情况相反。我们进一步使用基因干扰技术,通过shRNA抑制人软骨细胞中YY1的表达后,IL-1β介导的ChM-I表达下调得到缓解。而且软骨细胞内YY1的抑制使得条件培养基能更好的抑制HUVEC生物活性。结论OA关节软骨钙化层形态在早期就发生改变,这种改变与OA的病理变化相关;血管长入又是钙化层形态变化的重要原因;而OA软骨内血管长入与软骨内ChM-I、YY1蛋白的表达密切相关;通过IL-1β体外刺激人软骨细胞,可上调YY1表达而抑制ChM-I表达并降低软骨细胞对抗HUVEC增殖、迁移、侵袭和成小管的能力,当利用基因干扰技术抑制体外人软骨细胞YY1的表达后能明显缓解上述情况的发生。综上所述,OA软骨中炎症介质(IL-1β)通过YY1/ChM-I信号通路降低了ChM-I表达及软骨抗血管生成能力,导致血管长入软骨钙化层。