第一部分:脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的分离、培养、多系诱导分化及与纳米级胶原基骨材料(nHAC/PLA)复合的研究目的:分离和培养兔ADMSCs,并鉴定其多系分化潜能。与nHAC/PLA复合,检测细胞在支架材料上的活性和增殖速率。方法:脂肪组织取自成年新西兰白兔腹股沟处脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶消化分离出ADMSCs,基础培养基传代至P2改用诱导培养基继续培养,在体外进行ADMSCs的成脂肪、成骨、成软骨的诱导分化。成脂肪的诱导液组成是10% FBS ,0.5 mM isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1μM dexamethasone, 10μM insulin, 200μM indomethacin, 1% antibiotic/ antimycotic,诱导2周后用油红O检测诱导结果。成骨的诱导液组成为10%FBS 0.1μMdexamethasone, 50μM ascorbate-2-phosphate, 10mMβ-glycerophosphate, 1% antibiotic/ antimycotic。诱导2周时用钙钴法进行ALP的染色,4周时应用茜素红染钙化结节。应用悬浮微球法对ADMSCs进行成软骨分化的诱导,诱导液组成为:6.25μg/ml insulin, 10ng/ml TGF-1, 50nM ascorbate-2-phosphate, 1% antibiotic/ antimycotic。诱导2周时,进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,番红O染色和甲苯胺兰染色。应用旋转瓶对nHAC/PLA支架进行细胞接种,进行细胞接种率,细胞活性和细胞增殖速率的检测。结果:每25mg脂肪组织分离24h后,可以获得约1×106ADMSCs,细胞呈长梭型或多角形。P2代的ADMSCs用于诱导分化。在成脂肪诱导培养2周后,细胞中可见聚集的脂滴,成空泡状,油红O染色阳性。在进行成骨诱导2周时,ADMSCs行ALP的染色可见ALP的阳性表达。4周时进行茜素红染色,钙盐沉积物被染为红色颗粒。应用悬浮微球法进行成软骨诱导2周时,番红O染色和甲苯胺兰染色均为阳性表现,Ⅱ型胶原免疫组化染色提示ADMSCs表达软骨细胞特异性细胞外基质。应用旋转瓶接种细胞,细胞接种率可达95%,荧光染色定性检测表明细胞拥有良好的活性。MTT法检测表明接种后的细胞仍保持较快的增殖速率。结论:1脂肪间充质干细胞分离、纯化方法简单,增殖迅速,一次分离可以获得大量的种子细胞。2脂肪干细胞在特定条件下具有向软骨、骨及脂肪细胞分化的潜能。3利用旋转瓶可以获得较高的细胞接种率,同时保持细胞的活性和增殖潜能。第二部分:ADMSCs复合nHAC/PLA用于兔脊柱后外侧融合的研究目的:脊柱融合手术是治疗由椎间盘引起的腰痛的常规方法。应用自体髂骨移植一直是脊柱融合手术的金标准,但也存在一些不足,比如假关节形成、供区疼痛、手术时间长,出血多,术后需要输血。本实验探讨应用一种新的矿化基质骨材料nHAC/PLA结合ADMSCs用于兔脊柱融合模型的可行性。方法:40只成年新西兰白兔被分为4组,自体髂骨移植组(ACB)、单纯支架材料移植组( nHAC/PLA )、支架材料加自体骨组(ACB+nHAC/PLA),支架材料复合ADMSCs(ADMSCs+ nHAC/PLA)。10周后,对融合骨块进行手触检查评估融合程度,X线照射评估成骨范围,进行机械拉伸实验,检测融合部位力学强度。制作组织学标本,进行组织染色、免疫组织化学染色,扫描电镜观察新生骨组织的超微结构。结果: ACB组和ADMSCs+ nHAC/PLA组都可实现较高的融合率,显著高于nHAC/PLA组和ACB+nHAC/PLA组,ADMSCs+ nHAC/PLA组和ACB组比较无统计学差异。组织学的评估也表明在ACB组和ADMSCs+ nHAC/PLA有更多的骨组织形成。结论:我们的研究表明自体ADMSCs结合nHAC/PLA可以实现与自体骨移植相似的融合比率,可以作为自体骨移植的替代物用于脊柱融合。