斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:boyskys
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由于目前普遍采用的剪眼柄催熟法存在很多弊端,对斑节对虾繁育机理进行研究以寻找新的安全便利的催熟方法成为突破斑节对虾雌性性腺难以大批量集中成熟问题的研究重点和难点。本研究确定了实验用斑节对虾卵巢发育所处时期,检测了卵巢发育过程中血淋巴的四种激素的浓度变化,同时,克隆了与M期相关的MPP6基因,研究了MPP6基因表达情况及其与卵巢发育调控相关基因cyclinB以及cdc25的表达差异和相关性,为进一步研究与卵巢发育相关的激素和基因间的关联网络奠定基础,为研究斑节对虾卵巢发育调控机理提供参考资料。本实验采用石蜡切片和HE染色技术,结合解剖学、细胞学和组织学技术对斑节对虾卵巢各分期进行分类和鉴定,确定了实验用斑节对虾卵巢发育所处时期。主要鉴定依据为卵母细胞特征,即Ⅰ期卵巢中绝大多数细胞为卵原细胞,细胞小且细胞核比较大。Ⅱ期中大多数卵母细胞是染色质核仁期卵母细胞和周边核仁期卵母细胞。Ⅲ期中已出现少量的卵黄囊卵母细胞。Ⅳ期中大多数卵母细胞是卵黄囊卵母细胞。Ⅴ期中可见成熟的边缘布满皮质杆状体的卵母细胞。Ⅵ期中多数卵母细胞是染色质核仁期卵母细胞和周边核仁期卵母细胞及部分皮质杆状体的卵母细胞。采用化学发光法(Chemiluminesence immunoassay, CLIA)检测了卵巢发育阶段(Ⅱ期至Ⅵ期)血淋巴中促黄体生成激素(Luteinizing hormone, LH)、促卵泡生成激素(Follicle-stimulating hormone, FSH)、孕酮(Progesterone, P)和雌二醇(Estradiol, E2)的浓度和变化趋势。实验结果显示,卵巢发育过程中斑节对虾血淋巴中促黄体生成激素在卵黄积累阶段Ⅱ期至Ⅳ期浓度较高,Ⅱ期约为0.27mIU/ml和Ⅳ期约为0.24mIU/ml。卵巢成熟期Ⅴ期浓度最低约为0.10mIU/ml,而后在恢复期浓度增大。促卵泡生成激素的浓度在卵巢发育起始期Ⅱ期达到峰值(约0.13IU/ml),而后在卵巢发育过程中浓度持续下降,至卵巢成熟期Ⅴ期浓度最低(约为0.03IU/ml),而后在恢复期浓度增加。孕酮浓度在卵巢发育Ⅱ期缓慢升高,至Ⅵ期增长为105.3pg/ml。雌二醇浓度在卵巢发育期中浓度大致相同,最大值Ⅲ期(77.0pg/ml)为最小值Ⅳ期(68.7pg/ml)的1.2倍。斑节对虾血淋巴中E2浓度自Ⅱ期卵巢开始发育起一直维持在较高水平,且呈高低交替变化趋势。结果显示斑节对虾四种激素与卵巢发育有关,与其在脊椎动物中的功能一致可能发挥着促进卵巢发育的作用。采用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNAEnds, RACE)从斑节对虾总RNA反转录产物中获得了碱基长度为690bp的M期磷酸蛋白6(M-phase phosphoprotein6, MPP6)的全长cDNA序列,并命名为PmMPP6。该序列包含68bp的5’非编码区(UTR)和172bp的3’非编码区以及450bp的开放阅读框(ORF),可编码149个氨基酸。预测分子量为17.01kDa,理论等电点为4.89。序列比对分析表明PmMPP6与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的相似性和同源性最高。位点分析显示PmMPP6无糖基化位点,但是含有六个磷酸化位点,分别为5个Ser位点,1个Thr位点,没有Tyr位点。系统树分析显示PmMPP6归属于无脊椎动物大类。采用实时荧光定量PCR技术(Quantitative real time PCR, QRT-PCR)对三种基因进行表达检测的结果可知,cyclinB的mRNA在所检测的卵巢、淋巴、脑、血、肌肉、心、鳃、肝胰腺和肠9种组织中均有不同程度的表达,在卵巢内的表达量最高,淋巴次之,而在肝胰腺中的表达量最低。经单因子方差分析,斑节对虾cyclinB基因mRNA表达在卵巢中与其他组织存在极显著性差异(P<0.01)。cyclinB的mRNA在卵巢发育二至六期中的表达量大致相同,无显著性差异(P>0.05)。cdc25基因mRNA在所测的9种组织中均有不同程度的表达,在心脏中的表达量最高,肌肉次之,而在鳃中的表达量最低。经单因子方差分析,斑节对虾cdc25基因mRNA在组织表达中存在显著差异(P<0.05)。斑节对虾cdc25基因的mRNA在Ⅱ期卵巢表达量最高,Ⅲ期和Ⅳ期的表达量最低。在Ⅱ期卵巢中, mRNA相对表达量是在Ⅲ期中的1.6倍。经单因子方差分析,斑节对虾cdc25mRNA在卵巢发育期中的表达存在显著性差异(P0.05)。PmMPP6的mRNA在卵巢、淋巴、脑、血、肌肉、心、鳃、肝胰腺和肠中均有不同程度的表达,在淋巴内的表达量最高,肌肉次之,而在鳃的表达量最低。经单因子方差分析,PmMPP6的mRNA在组织表达中存在显著差异(P<0.05)。对卵巢发育二期至六期变化检测可知,PmMPP6的mRNA在Ⅱ期卵巢表达量最高,Ⅲ期的表达量最低。经单因子方差分析,斑节对虾M期磷酸蛋白6mRNA在卵巢发育期中的表达存在显著性差异(P<0.05)。
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