家畜优良性状的传递是通过生殖细胞来实现的。因此,了解生殖细胞的发育和分化,有利于培育高品质的家畜种群。然而,生殖细胞发生过程复杂,在体内难以获得且不易示踪,一直是研究生殖细胞发生的难点。干细胞具有独特的自我更新和多向分化能力,这使其成为了研究生殖细胞发育的有利工具。其中骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类存在于骨髓中的成体干细胞,取材方便且具有与胚胎干细胞相似的多向分化潜能,是目前用于诱导分化为生殖细胞的研究热点。研究表明,通过维甲酸(retinoicacid,RA)诱导等方式,已经实现了人和小鼠BMSCs体外向生殖细胞方向发生转分化,但获得的细胞均难以突破减数分裂。生殖细胞体内发生过程是在一系列相关基因调控下完成的,其中STRA8(stimulated by retinoic acid gene 8)主要在生殖细胞由有丝分裂转入减数分裂前表达,是生殖细胞重要的标记基因;BOULE和D 是 是DAZ(deleted in azoospermia)基因家族的重要成员,DAZL在生殖细胞性别分化、减数分裂启动等过程中发挥作用,BOULE在生殖细胞发生的后期表达,参与调控精母细胞的减数分裂和精子成熟等过程。近期的许多研究表明,通过人为调控细胞分化过程中某些关键基因的表达,可以有效地引起干细胞向特定的细胞表型转分化。因此,本研究以山羊BMSCs为研究对象,尝试通过过表达生殖细胞特异基因STRA8、BOULE和DAZL的方式来诱导山羊BMSCs体外向雄性生殖细胞转分化,探索多基因质粒DNA和体外转录mRNA非整合性过表达的诱导体系,为研究哺乳动物生殖细胞发生机理提供模型。主要的试验结果如下:试验一、山羊STRA8基因的表达及其真核表达载体的构建为研究STRA8基因在山羊睾丸发育过程中的表达,本试验首先通过免疫组化和qRT-PCR法检测STRA8基因在10日龄、4月龄、8月龄山羊睾丸组织中的表达情况,结果显示,STRA8在不同发育阶段的山羊睾丸组织中均表达,主要定位于精原细胞和初级精母细胞的细胞核中,其mRNA表达水平伴随着山羊睾丸发育而逐渐升高,其中8月龄组的STRA8基因表达水平显著高于10日龄组和4月龄组(P<0.05)。然后通过PCR法克隆得到了 1104 bp的山羊STRA8基因CDS序列,并亚克隆至pEX-4载体上。测序和双酶切试验表明,成功构建山羊STRA8基因真核表达载体pEX-4-STRA8。试验二、山羊BOULE和DAZL基因的表达及其真核表达载体的构建为进一步分析BOULE和DAZL基因在山羊睾丸组织中的表达特点,本试验首先通过免疫组化和qRT-PCR法检测BOULE和DAZL基因在10日龄、4月龄、8月龄山羊睾丸组织中的表达情况,结果显示,BOULE主要定位于精母细胞和精子细胞的细胞质中,在精原细胞中不表达;DAZL主要定位于精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞的细胞质中。BOULE和DAZL基因在8月龄组的mRNA表达水平均显著高于10日龄组和4月龄组(P<0.05)。然后通过PCR法对山羊BOULE和DAZL基因的CDS区进行克隆,分别得到了 816 bp的BOULE基因CDS区序列和966 bp的DAZL基因CDS区序列,并分别亚克隆至pEX-4和pEGFP-Cl载体上。测序和双酶切试验表明,成功构建了山羊BOUL和和DAZL基因真核表达载体pEX-4-BOULE和 pEGFP-DAZL。试验三、多基因质粒DNA诱导山羊BMSCs向雄性生殖细胞体外转分化的研究本试验建立了多基因质粒DNA诱导体系,通过过表达STRA8、BOULE和DAE和基因,促进山羊BMSCs向生殖细胞体外转分化。通过脂质体法转染质粒pEX-4-STRA8(iSTRA8)、pEX-4-BOULE(iBOULE)、pEGFP-DAZL(iDAZL)及三个质粒混合物(iSBD),进一步对比STRA8、BOULE和DAZL基因单独过表达和共同过表达在生殖细胞体外诱导过程中的效率。结果显示,各组诱导后的细胞均不同程度地表达原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分子标记STELLA、C-KIT、MVH,雄性生殖细胞相关分子标记DAZI、PIWIL2、RNF17,减数分裂相关分子标记SCP3。此外,在iSTRA8、iDAZL和iSBD组诱导后的细胞中,减数分裂相关蛋白SCP3的表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。这表明通过多基因质粒DNA转染的方式,可以诱导山羊BMSCs向雄性生殖细胞方向发生转分化,也提示了STRA8、BOULE和和DAZL基因所形成的调控网络可能在生殖细胞体外诱导过程中发挥重要作用。试验四、多基因mRNA诱导山羊BMSCs向雄性生殖细胞体外转分化的研究本试验进一步尝试通过体外转录合成STRA8、BOULE和DAZL基因的mRNA,实现目的基因在山羊BMSCs中非整合性过表达。分别对山羊BMSCs进行8天3次mRNA转染,其中共同过表达组(mi-SBD)3次均转染STRA8、BOUL和和DAZL基因的mRNA混合物,时序性过表达组(mi-S+BD)3次分别转染STRA8、STRA8+BOULE+DAZL、BOULE+DAZL 的不同 mRNA组合,进一步模拟STRA8、BOULE和DAZL基因在生殖细胞体内发育过程中的表达时序性。结果显示,首先,OCT4、STELLA、C-KIT、MVH、PIWIL2、RNF17、SCP3等生殖细胞相关分子标记的mRNA表达水平在诱导后的两组细胞中均出现不同程度地上调。其次,DAZL蛋白广泛表达于mi-SBD和mi-S+BD两组诱导后细胞的细胞质中;诱导后两组细胞中均出现SCP3阳性细胞,并且SCP3蛋白的表达水平均显著高于对照组(P<0.05);MVH蛋白的表达水平在mi-SBD和mi-S+BD两组诱导后的细胞中均得到显著上调(P<0.05),且mi-S+BD组显著高于mi-SBD组(P<0.05)。此外,mi-SBD组细胞的H19基因甲基化率显著低于对照组(P<0.05),而mi-S+BD组的甲基化率极显著低于对照组(P<0.01)。这表明mRNA诱导的山羊BMSCs已初步向雄性生殖细胞方向发生转分化,且时序性过表达的诱导方式模拟了生殖细胞体内发生过程中基因调控的时序性,提高了山羊BMSCs中生殖细胞相关基因和蛋白的表达水平,促进了减数分裂的启动,降低了印记基因H19甲基化率,诱导效果更佳。