【摘 要】
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目的:以“VDR/Nrf2/HO-1”通路为关键点,从动物实验和细胞实验两个方面,验证大黄素通过VDR/Nrf2/HO-1通路保护脓毒症肠屏障损伤的体内外调控机制,旨在从分子层面阐释大黄素保护脓毒症肠黏膜屏障损伤的作用原理,以期为大黄素治疗脓毒症提供科学的理论基础。方法:1、将48只Balb/c小鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、大黄素低（20mg/kg/d）、中（40 mg/kg/d）、高（
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目的:以“VDR/Nrf2/HO-1”通路为关键点,从动物实验和细胞实验两个方面,验证大黄素通过VDR/Nrf2/HO-1通路保护脓毒症肠屏障损伤的体内外调控机制,旨在从分子层面阐释大黄素保护脓毒症肠黏膜屏障损伤的作用原理,以期为大黄素治疗脓毒症提供科学的理论基础。方法:1、将48只Balb/c小鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、大黄素低（20mg/kg/d）、中（40 mg/kg/d）、高（80 mg/kg/d）浓度组、DEX组（1.8 mg/kg/d）,均采用CLP造模方法。应用MSS评分系统评价脓毒症小鼠疾病严重程度,利用HE染色法观察肠屏障损伤情况,采用Chiu分级系统来评价肠黏膜损伤。IHC法检测小鼠肠黏膜屏障蛋白的分布。使用Western-blot技术检测小鼠肠黏膜屏障分子及VDR/Nrf2/HO-1通路分子的蛋白表达。q RT-PCR技术用来检测小鼠肠黏膜屏障分子及VDR/Nrf2/HO-1通路分子的mRNA表达。采用试剂盒检测肠组织中促炎因子以及抗氧化酶相关指标。2、培养人肠上皮细胞系NCM460,分别设置正常组、si-NC组、si-VDR组、siVDR+LPS组、si-VDR+LPS+大黄素低浓度（15μg/m L）组、中浓度（30μg/m L）组、高浓度（60μg/m L）组、si-VDR+LPS+DEX（0.5μg/m L）组。利用si RNA干扰下调NCM460细胞中VDR分子的表达,向培养孔中加入LPS（1μg/m L）刺激造模。使用Western-blot技术检测NCM460细胞中黏膜屏障分子及VDR/Nrf2/HO-1通路分子的蛋白表达。q RT-PCR技术用来检测NCM460细胞中黏膜屏障分子及VDR/Nrf2/HO-1通路分子的mRNA表达。结果:1、小鼠MSS评分、HE染色、Chiu分级等结果显示脓毒症小鼠模型造模成功。模型组小鼠肠黏膜明显损伤缺失。大黄素干预可缓解脓毒症肠屏障损伤,且大黄素高浓度组保护作用优于中浓度组和低浓度组,差异有统计学意义。2、免疫组化染色表明,与模型组比较,大黄素组黏膜分子表达随浓度增加而逐渐增加。Western blot结果显示,CLP诱导的脓毒症小鼠肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达水平下降,大黄素给药后这些蛋白表达水平升高（P＜0.01）。q PCR结果显示,CLP诱导的脓毒症小鼠肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA表达水平下降,大黄素给药后mRNA表达水平升高（P＜0.01）。3、动物实验通路分子表达方面:模型组小鼠相对于正常组VDR水平明显降低,下游分子水平显著升高（P＜0.05）。不同浓度大黄素处理24 h后,低、中、高浓度大黄素组与模型组比较,VDR表达增加。大黄素（80 mg/kg）组下游p-Nrf2和HO-1水平显著高于DEX组（P＜0.01）。4、ELISA结果显示,与正常组相比,脓毒症模型小鼠肠组织中TNF-α、IL-6和MDA表达升高,SOD和GSH表达下降（P＜0.05）。与模型组相比,大黄素低、中、高浓度组和DEX组TNF-α、IL-6和MDA表达下降,SOD和GSH表达升高（P＜0.05）。5、在细胞实验中,Western blot结果显示,与si-VDR组相比,si-VDR-LPS组黏膜分子蛋白和mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。与si-VDR-LPS组相比,大黄素和DEX组ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白和mRNA表达水平显著升高。大黄素（30和60μg/m L）组ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白水平与DEX组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。6、细胞实验中,与正常组比较,si-VDR组VDR、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白水平显著降低（P＜0.01）。与si-VDR组相比,Model组VDR蛋白及mRNA表达降低,抗氧化分子p-Nrf2、HO-1升高。与si-VDR-LPS组相比,大黄素和DEX组VDR、p-Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著升高。结论:1、大黄素可通过VDR/Nrf2/HO-1通路保护脓毒症小鼠肠黏膜屏障损伤。2、大黄素可通过VDR/Nrf2/HO-1通路提高正常人上皮细胞NCM460肠屏障分子的表达。
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