第一部分 CTRP9在脓毒症诱导的急性肺损伤中的作用及分子机制研究研究背景脓毒症（sepsis）是由病原微生物感染引起机体免疫调节紊乱,造成危及生命的多器官功能障碍综合征,具有发病凶险,病死率高,预后差的特点。研究发现,大约30%的脓毒症患者可发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ disfuction syndrome,MODS）。据报道,肺是脓毒症发病过程中最易受侵袭的器官之一,在脓毒症造成的多脏器功能损伤中,最先引发的是急性肺损伤（acute lung injury,ALI）。脓毒症性ALI的主要发病机制之一是全身炎症反应失衡,中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞被过度激活,释放大量的细胞因子和炎性介质,增加肺部毛细血管的通透性、引发肺间质水肿、肺泡壁增厚和透明膜的形成,进一步发展可诱发急性进行性呼吸功能不全或呼吸衰竭。因此,改善脓毒症相关肺损伤的关键是调控炎性细胞的产生和炎症介质的释放。巨噬细胞作为释放各种炎性因子最主要的细胞,参与脓毒症相关肺损伤的发生和进展。其中,白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）是引发炎症级联反应的重要启动因子。研究数据表明IL-1β在急性肺损伤中显著增加并与肺损伤的严重程度密切相关。IL-1β的主要来源之一是炎性小体的激活,目前研究最广泛的炎性小体类型是NLRP3炎性小体,其参与介导多种炎症疾病的发生发展。NLRP3炎性小体是一种多蛋白组装而成的复合物,其组成成分包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）、含有CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like complex containing a CARD,ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1（cysteinyl aspartate speacific proteinase-1,Caspase-1）的前体形式。NLRP3炎性小体组装完成后,前体形式的Caspase-1被加工成为有生物活性的形式。接下来,有生物活性形式的Caspase-1不仅可以剪切前体形式的IL-1β和IL-18成为有生物活性的IL-1β和IL-18,还能够剪切gasdermin（GSDMD）蛋白,使其N端暴露并转移到细胞膜上打孔,细胞肿胀破裂,导致有活性的IL-1β和IL-18释放到细胞外、扩大炎症级联反应。这种由gasdermin蛋白介导的炎性小体依赖性的细胞程序性死亡方式叫焦亡。补体 1q/肿瘤坏死因子相关蛋白（C1q/tumor necrosis factor-related proteins,CTRPs）家族是结构上高度保守的一类脂肪因子家族,在体内分布广泛。CTRP9是CTRP家族的成员之一。研究表明,CTRP9在人体多个脏器中均可被检测到,如骨骼肌、睾丸、肝和肾,但其在脂肪组织和心脏中的表达量最高,这提示CTRP9可能通过不同的分泌方式在多个器官发挥作用。研究显示,CTRP9参与多种生理病理学过程,如糖脂代谢、免疫调节、细胞凋亡和氧化应激等。近年来,越来越多的研究开始关注CTRP9在炎症反应中的作用。本课题组前期的研究结果显示:CTRP9通过激活JNK通路促进巨噬细胞向M1型极化,导致炎性介质释放增多,加重炎症反应。NLRP3炎性小体是炎性疾病的重要干预靶点,CTRP9是否通过影响NLRP3炎性小体的激活,参与脓毒症相关肺损伤的炎症反应目前尚无报道。因此,本研究通过入组WT小鼠和CTRP9敲基因小鼠,构建脓毒症模型,探究CTRP9是否通过活化NLRP3炎性小体介导炎症反应,进而参与脓毒症诱导的急性肺损伤。另外,细胞实验我们选用小鼠腹腔巨噬细胞进行体外干预,进一步探究CTRP9对NLRP3炎性小体的影响及其分子机制。研究目的1.明确CTRP9在脓毒症诱导的急性肺损伤中的作用;2.探究CTRP9能否通过调控NLRP3炎性小体参与脓毒症诱导的急性肺损伤;3.探究CTRP9活化NLRP3炎性小体的相关分子机制。研究方法1.动物模型的建立CTRP9敲基因小鼠委托上海南方模式生物科技股份有限公司,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建。入组12 w龄雄性C57BL/6J小鼠（WT小鼠）和CTRP9基因敲除小鼠（CTRP9-KO小鼠）,通过LPS（10mg/kg）腹腔注射的方式构建脓毒症小鼠模型,12h后,小鼠出现精神萎靡、寒颤、腹泻、行动迟缓、眼角分泌物增多等一系列症状,脓毒症模型构建成功,此时对小鼠麻醉行安乐死,心尖采血灌流以后留取各脏器组织标本,包括肺、心脏、肝脏和肾脏等。2.肺组织病理学检测首先对四组小鼠的肺组织切片进行H＆E染色,大体观察小鼠肺组织的病理改变,接下来用F4/80标记巨噬细胞,采用免疫荧光染色的方法检测巨噬细胞在肺组织中浸润的数目,然后选用免疫组化和免疫荧光染色同时检测肺组织中IL-1β的表达量。3.酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）利用ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中IL-1β的含量。4.小鼠原代腹腔巨噬细胞的提取分别给与对照组小鼠及CTRP9敲基因小鼠腹腔注射6%的淀粉溶液,3 d后,用PBS灌洗小鼠腹腔获得细胞,离心后用含10%FBS的细胞培养基重悬细胞,将细胞平铺在合适孔径的细胞板中,置于37℃细胞培养箱中过夜。5.蛋白免疫印迹（Western blotting）提取小鼠腹腔巨噬细胞和肺组织的蛋白,检测NLRP3,ASC,Caspase-1的前体形式（Pro-Caspase-1）,IL-1β 的前体形式（Pro-IL-1β）,Caspase-1 的活性形式（Caspase-1 p10）,IL-1β 的活性形式（IL-1βp17）,GSDMD-FL,GSDMD-NT 和 NOX2 蛋白的表达量。6.实时定量PCR提取腹腔巨噬细胞RNA,利用逆转录试剂盒将RNA逆转录成较稳定的cDNA,使用荧光定量检测的方法检测巨噬细胞NLRP3和IL-1β的mRNA水平。7.细胞免疫荧光采用细胞免疫荧光染色的方式检测ASC斑点在巨噬细胞中的数目以及ROS在巨噬细胞内生成的量。8.PI染色将细胞均匀铺在12孔细胞培养板里,加入PI染料,使其终浓度为5 ng/ml,避光孵育30 min,使用荧光显微镜观察PI的着色率,以此判断细胞焦亡的情况。9.细胞转染加入NOX2小干扰,孵育8 h后换液,24 h后进行其他干预,利用Western blotting技术检测干扰效率。10.流式细胞术在腹腔巨噬细胞中加入含有DCFH-DA的无血清培养基,避光37℃孵育20 min,用PBS清洗后转移到流式管中,通过流式细胞术检测细胞内ROS的含量。11.统计学分析定量数据表示为均数±标准差（mean±SD）。对于所有符合正态分布的数据,选择对数秩检验用于生存曲线的分析,选用独立样本t检验的统计方法进行两组之间的比较,利用单因素方差分析的统计方法进行三组以上的比较,p＜0.05被认为具有统计学意义。实验结果1.CTRP9基因敲除小鼠的构建提取CTRP9基因敲除小鼠和WT小鼠肺脏、心脏组织和腹腔巨噬细胞蛋白,利用Western blotting技术进一步检测CTRP9基因敲除的效率,结果显示:CTRP9蛋白在CTRP9-KO小鼠的肺脏、心脏组织和腹腔巨噬细胞中的表达均缺失,这提示CTRP9敲基因小鼠构建成功。2.在脓毒症小鼠的肺组织中CTRP9的表达量明显上调为了探究脓毒症疾病模型中CTRP9的表达量是否有变化,我们给与WT小鼠腹腔注射PBS或LPS（10 mg/kg）,12 h后对小鼠行安乐死,留取小鼠的肺组织,利用Western blotting检测CTRP9蛋白的表达量,结果发现:CTRP9在脓毒症小鼠的肺脏中的表达量明显高于正常对照组小鼠。3.CTRP9基因敲除减轻脓毒症性肺损伤和炎症反应首先对入组的WT小鼠与CTRP9-KO小鼠给与腹腔注射LPS,平均每间隔8 h观察一次小鼠的生存状态,记录小鼠的生存时间直到最后一只小鼠死亡,分析数据并绘制生存曲线。通过我们的观察记录发现:CTRP9-KO脓毒症小鼠的存活率明显高于WT脓毒症小鼠。接下来,我们将小鼠分成四组,WT小鼠正常对照组,CTRP9-KO小鼠正常对照组,WT小鼠脓毒症组,CTRP9-KO小鼠脓毒症组,12 h后对四组小鼠行安乐死,留取组织标本。对四组小鼠的肺组织进行H＆E和免疫荧光染色,结果显示:与正常对照组相比,脓毒症小鼠的肺组织间隔增厚,并伴随大量巨噬细胞的浸润;与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9-KO脓毒症小鼠的肺组织间隔增厚程度明显减轻,巨噬细胞浸润的数目显著减少。另外,我们通过ELISA检测小鼠血清中IL-1β的含量,结果显示:脓毒症小鼠血清中IL-1β的含量明显增多,CTRP9基因敲除可降低脓毒症小鼠血清中IL-lβ的含量。此外,我们用免疫组织化学和免疫荧光染色检测小鼠肺组织中IL-1β的表达量,结果表明:CTRP9基因敲除可显著降低脓毒症小鼠肺组织中IL-1β的表达。4.CTRP9基因敲除抑制脓毒症小鼠肺组织中NLRP3炎性小体的活化接下来,我们通过Western blotting进一步检测NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、Caspase-1 p10、IL-1β p17和焦亡相关蛋白GSDMD-NT在小鼠肺组织中的表达情况,结果显示:脓毒症小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1 p10、IL-1βp17和GSDMD-NT的表达量明显增加,CTRP9基因敲除可显著降低脓毒症小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1 p10、IL-1βp17 和 GSDMD-NT 的表达。5.CTRP9基因敲除抑制巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化提取WT小鼠和CTRP9-KO小鼠的腹腔巨噬细胞,首先我们通过Western blotting检测巨噬细胞CTRP9蛋白的表达情况,发现CTRP9-KO小鼠的腹腔巨噬细胞中CTRP9蛋白的表达量极低。然后,在巨噬细胞中加入NLRP3炎性小体的诱导剂LPS和ATP刺激,Western blotting结果显示:CTRP9基因敲除后,细胞上清中具有生物活性的Caspase-1 p10和IL-1β p17的释放明显减少,细胞中NLRP3和Pro-IL-1β蛋白的表达量也明显降低,但Pro-Caspase-1和ASC蛋白的表达量无明显变化。6.CTRP9基因敲除抑制巨噬细胞焦亡PI染色结果显示:CTRP9-KO小鼠腹腔巨噬细胞发生焦亡的比例明显减少。我们进一步用Western blotting检测焦亡相关蛋白GSDMD的切割情况,结果发现CTRP9-KO小鼠腹腔巨噬细胞中GSDMD-NT的表达量明显降低,这提示CTRP9基因敲除抑制GSDMD蛋白的切割。7.外源性的CTRP9促进巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化为了进一步明确CTRP9对巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化的作用,我们用外源性的CTRP9重组蛋白提前预处理巨噬细胞,然后用NLRP3炎性小体的诱导剂LPS和ATP刺激巨噬细胞,PCR结果显示:CTRP9+LPS+ATP组NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA水平较LPS+ATP组明显增加。Western blotting检测上清液蛋白的表达量发现:CTRP9+LPS+ATP组细胞上清中有生物活性的Caspase-1 p10和IL-1β p17的释放也明显增加。我们还发现:巨噬细胞经过CTRP9预处理后,NLRP3蛋白的表达量明显增多,但ASC和Pro-Caspase-1蛋白的表达量没有明显变化。此外,越来越多的研究认为,ASC斑点的形成是NLRP3炎性小体被激活的另一个显著标志。我们通过细胞免疫荧光染色标记ASC斑点,结果显示:在单纯受到LPS刺激的巨噬细胞中,ASC在细胞内均匀分布,给予细胞ATP刺激可促进ASC斑点的形成。此外,我们发现CTRP9+LPS+ATP组的巨噬细胞中,ASC斑点的形成明显增多。总之,以上结果显示CTRP9可促进NLRP3炎性小体的活化。8.外源性的CTRP9促进巨噬细胞焦亡利用PI染色标记焦亡的巨噬细胞。我们发现,与LPS刺激组相比,LPS和ATP刺激组中PI染色呈阳性的巨噬细胞数量显著增加,这表明LPS和ATP共同刺激可以成功诱导巨噬细胞焦亡模型。CTRP9+LPS+ATP组PI染色呈阳性的巨噬细胞比例明显增加。与此同时,Western blotting结果显示:CTRP9可增加细胞焦亡相关蛋白GSDMD的切割。以上结果表明CTRP9可以促进巨噬细胞焦亡。9.CTRP9促进巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化和细胞焦亡是通过NOX2/ROS途径流式和细胞免疫荧光染色检测巨噬细胞内ROS的含量。结果均证实外源性CTRP9可促进巨噬细胞内 ROS 的生成,加入ROS的抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）后,流式检测发现ROS的生成减少,Western blotting检测发现NLRP3炎性小体及细胞焦亡相关蛋白的表达均受到明显抑制。研究报道,NOX2是细胞内ROS的重要来源之一。Western blotting检测发现:CTRP9显著增加NOX2蛋白的表达。接下来,我们对巨噬细胞转染NOX2小干扰,结果发现:干扰NOX2后,ROS的生成减少,CTRP9对NLRP3炎性小体和细胞焦亡的促进作用也被明显抑制,表明NOX2/ROS信号通路参与CTRP9对NLRP3炎性小体的活化。结论1.CTRP9基因敲除减轻脓毒症相关肺损伤中的炎症反应;2.CTRP9基因敲除抑制NLRP3炎性小体的活化;3.CTRP9通过NOX2/ROS信号通路促进NLRP3炎性小体的活化进而加重炎症反应。第二部分 CTRP9在脓毒症诱导的急性心肌损伤中的作用及机制研究研究背景脓毒症是因感染引起的全身炎症反应失调,常造成多器官功能障碍,其中,心肌损伤是脓毒症患者临床上较为常见并发症之一,发病率高达40%。研究发现:脓毒症心肌损伤的发病机制可能与线粒体功能障碍、代谢异常、氧化应激、自主神经功能失调等有关。其中,氧化应激反应一直以来被认为是诱导脓毒症心肌损伤的重要发病机制。脓毒症损伤的心肌组织中,氧化还原失衡,主要体现在氧自由基的生成增加和抗氧化能力的下降。脓毒症发生时,心肌组织中募集的巨噬细胞和中性粒细胞可通过NADPH氧化酶上调细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,过度累积的ROS破坏生物膜结构,尤其是线粒体膜和溶酶体膜,导致心肌细胞功能障碍;另外,脓毒症发生后,抗氧化能力下降,体现在心肌组织中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxidase,GSH-PX）和过氧化氢酶（catalase,CAT）和低分子量抗氧化剂如维生素E、维生素A、维生素C和辅酶Q10明显减少,上述抗氧化物水平的下调会引起氧自由基的清除障碍,进而破坏心脏的收缩功能。铁死亡是氧化应激失衡所导致的新型细胞死亡方式,主要表现为抗氧化体系谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase4,GPX4）表达量的降低,铁超载引起的脂质过氧化增加。目前大家对铁死亡的了解还不够充分。经过早期的探索,人们发现有多种机制参与铁死亡的发生,其中包括铁离子的转运、谷胱甘肽（L-Glutathione,GSH）耗竭或GPX4失活以及ROS的过量积累。研究发现,铁死亡与帕金森病、癌症、糖尿病、脑血管疾病等多种疾病相关。铁死亡还参与了心肌病的发展,包括心肌肥大、糖尿病性心肌病和多柔比星诱导的心脏毒性。最近Ning Li团队的研究报道,铁死亡在脓毒症诱导的心肌损伤中也发挥不容小觑的作用。目前关于铁死亡的具体调控机制尚不清晰。核转录因子-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作为机体抗氧化体系中关键的转录因子,可促进下游一系列抗氧化酶（如GPX4和HO-1等）的表达。然而,有研究证实和铁死亡相关的基因几乎都由Nrf2调控,因此,Nrf2被认为是铁死亡的关键调控因子。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9（C1q/TNF-relative protein 9,CTRP9）,是近年来备受关注的新型脂肪细胞因子。有数据表明CTRP9在心脏组织中的高表达,并在心脏组织中裂解成含球状结构域（gCTRP9）的活化形式,释放到局部心脏组织或伴随循环系统到达全身各处发挥作用。然而,CTRP9在心血管疾病中既发挥保护作用,又产生不利影响。一方面,有研究报道,CTRP9可以减轻缺血再灌注造成的心肌损伤;CTRP9还可以通过抑制炎症反应、改善内皮功能障碍、抑制VSMCs向巨噬细胞样细胞转分化等方式阻止动脉粥样硬化的发展;另一方面,有研究报道,与正常人相比,高血压患者血清中CTRP9的水平明显升高,并与高血压相关动脉粥样硬化的发生相关;在肥厚型心肌病中上调CTRP9可促进心肌重构向适应性不良的方向发展甚至导致左心衰竭。综上所述,CTRP9发挥不同的效应可能是因为其与不同的受体结合,或者是因为其参与不同的疾病模型而发挥不同的生物学功能。因此,CTRP9在心血管系统疾病中的具体作用和机制需要我们继续深入研究。我们前期的研究结果显示:CTRP9在脓毒症小鼠心肌组织中的表达量明显上调,这提示CTRP9和脓毒症心肌损伤可能存在相关性。然而,CTRP9是否通过影响铁死亡参与心血管疾病的发生发展目前尚无报道,本研究旨在探究CTRP9是否通过介导铁死亡参与脓毒症诱导的急性心肌损伤。研究目的1.明确CTRP9在脓毒症诱导的急性心肌损伤中的作用;2.探究CTRP9是否通过介导心肌铁死亡参与脓毒症性心肌损伤;3.探究CTRP9诱导心肌铁死亡的具体分子机制。研究方法1.动物模型的建立上海南方模式生物科技股份有限公司构建CTRP9基因全身敲除小鼠。分别入组12 w龄雄性C57BL/6J小鼠和CTRP9基因敲除小鼠（CTRP9-KO小鼠）,给与腹腔注射LPS（10 mg/kg）,12 h后建立脓毒症小鼠模型。对小鼠行安乐死,并留取血清、肺脏、心脏、肝脏和肾脏等组织标本。2.小鼠基因型鉴定剪长度为1 cm左右的鼠尾,使用组织DNA抽提试剂盒,根据操作步骤,加入不同的试剂,提取得到鼠尾DNA,进行PCR扩增,然后行琼脂糖凝胶电泳后曝光可观察到条带位置。此外,利用蛋白免疫印迹技术检测心肌组织中CTRP9的表达水平,验证CTRP9基因的敲除效率。3.心功能评估吸入异氟烷方式将小鼠麻醉,使用脱毛膏脱去小鼠胸部毛发,将小鼠仰卧位固定在平台上,四肢贴上电极片,在胸部涂抹耦合剂。在胸骨旁行心脏超声检查,通过分析获得的测量数据,计算左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）和左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）。4.心肌组织H＆E染色观察心肌组织的病理改变。5.蛋白免疫印迹（Western blotting）检测乳大鼠原代心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）中Nrf2,血红素氧合酶 1（heme oxygenase-1,HO-1）,GPX4,胱氨酸/谷氨酸反向转运体（cystine/glutamate antiporter）xCT,转铁蛋白受体（transferrin receptor,TFR）和转铁蛋白（transferrin,TRF）的表达量。6.统计学分析定量数据表示为均数±标准差（mean±SD）。对于所有符合正态分布的数据,选择独立样本t检验的统计方法进行两组数据之间的比较,选用单因素方差分析的统计方法进行三组以上数据之间的比较。p＜0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.CTRP9基因敲除可改善脓毒症小鼠心脏的收缩功能我们分析了四组小鼠心脏超声的检查结果,数据显示:与正常对照组相比,脓毒症小鼠组心脏LVEF和LVFS明显降低;与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9敲基因脓毒症小鼠的LVEF和LVFS明显升高,提示CTRP9基因敲除后,脓毒症小鼠心脏的收缩功能得到明显改善。2.CTRP9基因敲除可缓解脓毒症诱导的心肌损伤我们对心肌组织进行H＆E染色,结果显示:正常对照组小鼠心肌细胞排列整齐,脓毒症小鼠的心肌细胞明显肿胀而且排列紊乱,炎性细胞浸润增多。另外,与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9-KO脓毒症小鼠的心肌组织肿胀程度较轻,炎性细胞浸润的数目明显减少。除此之外,我们检测了四组小鼠的血清发现:脓毒症小鼠血清中心肌肌钙蛋白 Ⅰ（cardiactroponin I,cTnI）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB,CK-MB）的浓度显著升高;与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9-KO脓毒症小鼠血清中cTnI和CK-MB的含量明显降低。3.CTRP9敲除抑制脓毒症小鼠心肌组织发生铁死亡我们通过Western blotting技术检测四组小鼠心肌组织中铁死亡相关蛋白的表达量,结果显示:铁代谢相关蛋白TFR和TRF在LPS诱导的脓毒症小鼠心肌组织中的表达量明显上调,但CTRP9的敲除抑制了 TFR和TRF的表达。另外我们还发现,LPS诱导的脓毒症小鼠心肌组织中GPX4和xCT的表达量显著下降,CTRP9基因的敲除逆转了这一现象。4.外源性的CTRP9促进LPS诱导的NRCMs铁死亡为了在体外进一步验证了 CTRP9对心肌细胞铁死亡的影响,我们给与新生大鼠原代心肌细胞LPS刺激来模拟脓毒症心肌细胞损伤模型。Western blotting检测铁死亡相关蛋白TFR,TRF,GPX4和xCT在NRCMs中的表达情况,结果表明:加入外源性的CTRP9重组蛋白后,与LPS刺激组相比,LPS+CTRP9组TFR和TRF的表达量明显增多,GPX4和xCT蛋白的表达量显著减少,这提示CTRP9促进LPS诱导的NRCMs铁死亡。5.CTRP9基因敲除可减轻脓毒症小鼠心肌组织氧化应激为进一步探究CTRP9介导脓毒症心肌损伤的作用机制,我们接下来检测了四组小鼠心肌组织的氧化应激水平。免疫荧光染色发现,与正常对照组相比,脓毒症小鼠组心肌组织中ROS的生成明显增多,与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9-KO脓毒症小鼠心肌组织中ROS的水平明显降低。另外,与WT脓毒症小鼠相比,CTRP9-KO脓毒症小鼠心肌组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的含量增多,氧化应激产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量明显减少。6.外源性的CTRP9促进LPS诱导的NRCMs中ROS的生成为了在体外进一步验证了 CTRP9对心肌细胞ROS的影响,我们利用免疫荧光染色观察NRCMs中ROS的水平,结果显示:与LPS组相比,LPS+CTRP9组ROS的生成显著增多。7.CTRP9基因敲除促进脓毒症小鼠心肌组织中Nrf2和HO-1的表达为了进一步研究Nrf2/HO-1信号通路是否参与CTRP9促进脓毒症心肌损伤的过程,我们进行了免疫组织化学染色发现:脓毒症心肌损伤后,抗氧化蛋白Nrf2的表达明显下降,CTRP9基因敲除可逆转这一现象。接下来,我们通过Western blotting检测抗氧化蛋白Nrf2和HO-1在各组小鼠心肌组织中的表达量,结果发现:Nrf2和HO-1蛋白在CTRP9-KO脓毒症小鼠心肌组织的表达量显著高于在WT脓毒症小鼠心肌组织中的表达。8.外源性的CTRP9抑制Nrf2和HO-1在LPS诱导的NRCMs中的表达为了进一步明确CTRP9对Nrf2/HO-1信号通路的作用,我们通过Western blotting检测发现:与对照组相比,LPS诱导的NRCMs中Nrf2和HO-1蛋白的表达受到抑制,与此同时,与LPS组相比,CTRP9+LPS组Nrf2和HO-1蛋白的表达显著降低。9.SFN可逆转CTRP9对LPS诱导的NRCMs铁死亡的促进作用为了进一步验证CTRP9通过Nrf2/HO-1信号通路促进LPS诱导的NRCMs铁死亡,我们用Nrf2的激动剂的SFN提前预刺激NRCMs。通过Western blotting检测发现,与LPS+CTRP9组相比,LPS+CTRP9+SFN组中TFR的表达量明显下降,xCT和GPX4蛋白的表达水平明显增加。结论1.CTRP9基因敲除可减轻脓毒症诱导的急性心肌损伤;2.CTRP9基因敲除可抑制脓毒症诱导的心肌铁死亡;3.CTRP9通过Nrf2/HO-1信号通路促进LPS诱导的NRCMs铁死亡。