论文部分内容阅读
近几年来的研究表明，抗菌肽是生物在漫长进化历程中保存下来的天然免疫机制之一，并且已经在海洋软体动物中发现了一些新的抗菌肽家族成员。该家族是由特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽。在双壳贝类中，贻贝的抗菌肽研究较为透彻，而其他双壳贝类的抗菌肽研究报道不多，因而其他贝类抗菌肽是一个有很大研究开发价值的领域。随着许多抗菌肽cDNA成功地克隆，研究人员正逐渐放弃从低等动物血淋巴直接分离纯化(如酸提、层析等)抗菌肽的繁琐步骤，转而利用现代分子生物技术结合基因工程方法获得大量的新的抗菌肽。
目的：
1.初步建立一种全新的基于“cDNA末端快速扩增PCR”(RACE)的双壳贝类栉江珧抗菌肽基因cDNA快速筛选鉴定方案；
2.运用新的初步筛选方案钓取与双壳贝类抗菌肽基因具有高同源性的基因并克隆其基因。
方法：
1.总RNA提取及反转录从栉江珧闭壳肌抽取血淋巴，TRIzol法提取血细胞总RNA，采用AMVReverseTranscriptase试剂盒进行反转录获得cDNA。
2.抗菌肽基因筛选方案一1)根据已知抗菌肽Mytilins的cDNA5′端保守序列设计抗菌肽基因特异性引物，另一个引物与mRNA差异显示法(DDRT-PCR法)简化的锚定引物相同；2)利用锚定引物和基因特异性引物进行3′cDNA末端快速扩增PCR(3′RACE)，获得带有双壳贝类抗菌肽cDNA3′端保守序列的扩增产物；3)扩增产物通过AT克隆法连接至pGEM-TEasy载体中，挑选阳性重组子并进行DNA序列分析；
4)测序结果进行BLAST，与GenBank和NCBI数据库中的抗菌肽基因进行同源性比较。
3.抗菌肽基因筛选方案二
1)根据Mytilins基因的保守序列设计特异性简并引物，用5′RACE试剂盒进行cDNA末端快速扩增PCR(5′RACE)；
2)扩增获得带有双壳贝类抗菌肽保守序列cDNA的5′端基因片段，经AT克隆至pGEM-TEasy载体中；
3)挑选阳性重组子，进行DNA序列分析；
4)测序结果进行BLAST，与GenBank和NCBI数据库中的抗菌肽基因进行同源性比较。
结果：
1.通过3′cDNA末端快速扩增法从栉江珧血淋巴总RNA扩增出多个带有双壳贝类抗菌肽保守序列的3′端基因片段，其长度在800bp以下；
2.AT克隆至pGEM-TEasy载体中构建重组载体，筛选出阳性重组子及进行DNA全序列分析得到2个未知基因的3′端碱基序列信息；
3.根据设计的Mytilins基因特异性简并引物，用5′cDNA末端快速扩增法从栉江珧血淋巴总RNA扩增出多个带有双壳贝类抗菌肽保守序列未知基因的5′端基因片段，其长度在800bp以下；
4.进行AT克隆，筛选出阳性重组子克隆并进行DNA序列分析得到3个未知基因的5′端碱基序列信息；
5.根据上述两种方法筛选得到的未知基因碱基序列信息与数据库中双壳贝类抗菌肽cDNA序列进行同源性比较显示与抗菌肽Mytilins基因同源性不高；
6.由于时间的限制未能进一步进行全长cDNA克隆，获得cDNA的全部碱基序列信息。因此，尚无法确定上述获得的带有双壳贝类抗菌肽保守序列的5个未知基因片段是否为新的抗菌多肽基因。
结论：利用设计的锚定引物、基因特异性引物和简并引物，运用3′RACE和5′RACE等多种实验技术方法，在栉江珧钓取出带有双壳贝类抗菌肽保守序列的未知基因。本实验对初步建立一种全新的双壳贝类抗菌肽基因cDNA快速筛选鉴定方案提供了一定的实验依据。