细胞内维生素C的荧光探针的设计合成及动态可视化分析

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生物体内的还原性物质和氧化性物质对于维持生命体内正常的生命活动过程起着非常重要的作用。还原性物质具有许多生理功能,如抗氧化性、抗应激性、抗癌作用以及增强免疫力。适当的氧化性物质对于维持正常的氧化还原平衡也是极其重要的。但是当这些氧化性的物质过量时,就会对细胞内的生理功能产生影响,导致DNA氧化损伤和突变,最终可能引起癌症和其它疾病。大量研究证明,细胞内的Vc与细胞的生理病理过程有着密切关系,而Vc等抗氧化剂可以清除细胞内自由基,防止DNA受损伤。而当Vc等抗氧化剂的浓度减少时,会导致细胞内的自由基大量积累,不能被及时清除,癌症的发病率显著增多。因此我们研究Vc在细胞内的信号转导有着非常重要的意义。目前检测Vc和脱氢Vc的方法主要有分光光度法、液相色谱法、电化学方法、质谱法、荧光法等。但是真正能用于生物体系检测的方法还很少。因为在测量中始终存在一定的问题,比如荧光法:在检测的时候受到其它物质的干扰问题严重,如NO和一些还原型的物质都会对检测Vc造成干扰;灵敏度低,Vc的浓度要增加到毫摩尔级才会对探针有响应;操作比较麻烦。因此设计一种有效的检测Vc的方法成为目前医学上研究的重点。本文主要开展了两方面的研究工作:(一)本章合成了一种检测脱氢Vc(DHAA)代谢产物的近红外荧光探针,基于精氨酸中的胍基与邻二酮基团的特异性反应,以花菁为母体,精氨酸(Arg)为识别基团。由于激发态分子内电荷转移(ICT)对荧光的猝灭效应,探针本身荧光比较弱,与脱氢Vc的代谢产物反应之后生成一种羰基化合物,探针内部电荷分布发生了变化,荧光增强。首先对探针的光谱性质进行了检测,探针的激发和发射的波长分别为680nm和749nm,斯托克斯位移为69nm。然后初步探测了探针对细胞内脱氢Vc的响应,实验表明细胞内脱氢Vc与探针的响应很快,因此我们利用细胞破碎液在化学体系中实现了对脱氢Vc代谢产物的分析,在0-10μM范围内荧光强度与脱氢Vc浓度的线性方程为F=323.09+31.25[DHAA](μM),相关系数为0.9969,并且具有较高的选择性,对生物体内常见的一些物质如:半胱氨酸、葡萄糖、一氧化氮、过氧化氢、超氧阴离子、多巴胺、钾离子、钠离子、锌离子等不干扰。(二)在本章中我们研究了探针Arg-Cy在细胞内的性能。实验表明探针的膜透性好、生物毒性低、抗光漂白性能好。此外,Arg-Cy的发射波长位于红外区,可以有效地避免生物样品中自发背景荧光的干扰。然后对肝细胞和肝癌细胞中脱氢Vc进行了成像,实验发现肝癌细胞中加入探针进行荧光成像,荧光强度很弱,然后加入脱氢Vc,荧光强度增强;肝细胞中加入探针荧光成像,荧光强度很弱,加入脱氢Vc,荧光强度基本不变。基于以上实验结果我们选用Cy-O-ebselen探针验证了正常细胞与肿瘤细胞内的氧化还原环境的不同对脱氢Vc代谢产物的影响。肝细胞处于一种正常的氧化还原态,脱氢Vc进入细胞之后被GSH或者一些还原酶很快还原成Vc,代谢的相对较少;肿瘤细胞基本上处于一种氧化状态,脱氢Vc进入细胞之后很快就被代谢。该探针有可能为研究Vc在细胞内的转化过程提供新的工具。
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