论文部分内容阅读
小麦是世界上最重要的谷类作物之一,主要分布在干旱和半干旱的地区,干旱是限制小麦生长、发育和产量的主要因子。在有限的水分条件下提高小麦的生产能力,对稳定和提升小麦生产水平具有十分重要的意义。蒸腾效率反映植物耗水与干物质生成之间的关系,是与作物抗旱节水相关的重要指标。拟南芥ERECTA基因是调控植株蒸腾效率指标—碳同位素分辨率(CID)的一个主效QTL位点,可解释其变异的21%-64%。为了明确其在小麦中的同源基因—TaER在调控小麦蒸腾效率的功能及其作用的机理,本研究对小麦TaER基因进行了序列分析和比较,分析了其在不同器官和胁迫下的表达模式,采用BSMV诱导的基因沉默(VIGS)和转基因过量表达分析其功能,以解析其调控小麦蒸腾效率的机理,并分析了其在小麦自然群体中的表达水平与蒸腾效率相关生理指标和产量性状的相关性,为利用TaER基因提高小麦的蒸腾效率和生产潜力奠定理论基础。本研究取得的主要研究结果如下:1.小麦TaER家族基因的序列分析及表达特性利用URGI数据库,电子拼接得到小麦TaER2和TaER1(分别位于第6和第7同源群)在A、B和D基因组上的6个拷贝序列,第7同源群的命名为TaER1AS、TaER1BS和TaER1DS,第6同源群的命名为TaER2AL、TaER2BL和TaER2DL。比对分析表明这6个拷贝的序列高度相似,以小麦品种Cadenza为模板,分离TaER1BS基因的cDNA序列,比对结果表明TaER1BS与其他物种中类受体激酶家族(RLKs)的氨基酸序列高度相似,确定了TaER1BS的功能域,利用原核表达系统对TaER1BS激酶区蛋白进行诱导表达,western blot进一步鉴定了目的蛋白。以中国春为材料,采用半定量RT-PCR分析TaER1BS基因在小麦不同发育时期小麦根、茎、叶和穗中的的表达模式,结果表明:TaER1BS在拔节期的根和茎中表达量较高,在萌发期的叶中表达量较高,在孕穗期的穗中表达量较高;对中国春幼苗进行激素(GA3,ABA,BRs和IAA)和胁迫(脱水和MgSO4)处理,采用qRT-PCR分析TaER1BS基因对激素和胁迫的响应,结果表明:在GA3,ABA和MgSO4处理下,TaER1BS的表达被显著抑制;在BRs,IAA和脱水处理下,TaER1BS的表达首先轻微下调,然后随着处理时间的延长,其表达显著上调。2.TaER家族功能的VIGS分析利用BSMV-VIGS系统,分别选择TaER1和TaER2家族的亮氨酸富集区(LRR),跨膜区和丝氨酸/苏氨酸激酶区共6个区段,以及TaER1和TaER2的共同的亮氨酸富集区(LRR)和丝氨酸/苏氨酸激酶区共2个区段,分别构建BSMV的沉默载体。在苗期分别对小麦品种晋麦47、Bobwhite和Cadenza进行侵染,分析沉默后小麦植株叶片的相关结构和生理指标的变化。结果发现:除所有选择的区段在Bobwhite中沉默表型都不明显,及丝氨酸/苏氨酸激酶区的沉默表型在Cadenza和晋麦47中不明显,其它区段的沉默表型在Cadenza和晋麦47中沉默表型都较明显。TaER1或者TaER2家族单独沉默后,各自家族的表达水平显著降低,而另外一个家族基因表达水平较稳定;TaER家族全部沉默后,则两个家族基因表达水平均极显著降低。TaER1、TaER2和TaER家族基因分别沉默后,Cadenza和晋麦47植株叶片的气孔密度均增加,说明TaER在调控叶片的气孔发育方面具有重要功能。在正常浇水和干旱胁迫下,进一步测定其蒸腾和光合效率相关指标,发现TaER基因沉默增加气孔密度后导致气孔导度、胞间CO2浓度、光合速率和瞬时水分利用效率(WUEi)均明显下降,而蒸腾速率明显升高,表明该基因的沉默均会导致小麦植株叶片的水分利用效率大大降低。3.TaER1BS功能的过表达分析构建TaER1BS基因的过表达载体,利用基因枪转化受体小麦Cadenza,获得TaER1BS的过表达株系。在T0代,TaER1BS基因的表达水平较对照提高14-111%,在T1代平均提高71%。与野生型相比较,过表达株系旗叶面积显著增加,气孔密度显著降低,气孔细胞和表皮细胞尺寸均增加,导致过表达株系CO2饱和点较高,表明TaER在调控小麦叶片的生长发育中具有重要功能,且过表达株系生育期延长。TaER1BS基因过表达后使得小麦旗叶面积显著增加、气孔密度降低,提高了旗叶的CO2饱和点,这一结论与BSMV-VIGS基因沉默的结果一致。在正常浇水条件下,TaER1BS基因过表达株系的光合速率和气孔导度均极显著增加,蒸腾速率极显著下降;在干旱胁迫下,相比正常浇水,植株光合生理指标都较低,而TaER1BS基因过表达株系的光合速率和气孔导度仍然显著增加,蒸腾速率极显著下降,CID显著降低,而SPAD值、相对水分含量和胞间CO2浓度在过表达株系和对照株系之间没有差异。收获后考种,过表达株系的株高、穗粒数、千粒重、单株生物量和单株产量较对照均增加。说明TaER的过表达可通过调控小麦叶片的发育,增大叶面积,降低气孔密度,提高光合速率和蒸腾效率,进而提高小麦植株的生物量和产量。4.TaER家族基因表达与蒸腾效率相关指标的关联分析在大田种植碳同位素分辨率(CID)差异较大的48个小麦品种,在抽穗期和灌浆期调查其旗叶蒸腾效率相关生理指标,同时采用qRT-PCR分析TaER1(Chr7)和TaER2(Chr6)在旗叶中的表达水平,分析其表达水平与蒸腾效率指标的相关性。结果表明:在两个生育时期,TaER1和TaER2的表达量与旗叶的气孔密度呈极显著负相关,与旗叶面积呈极显著正相关,与光合速率和瞬时水分利用效率呈显著正相关,与蒸腾速率呈显著负相关,与CID呈极显著负相关,且TaER基因表达量高的小麦品种具有较高的单株生物量和单株产量。这些结果说明TaER表达量与旗叶面积和气孔密度、光合速率和水分利用效率等具有良好的的相关性,可利用TaER的表达量作为筛选小麦蒸腾效率相关指标的替代指标,提高小麦蒸腾效率的选择效率。总之,小麦中TaER基因具有6个拷贝,序列具有高度相似性,其在快速分化发育的幼嫩组织中大量表达,对外界逆境胁迫具有强烈的响应。通过对TaER家族基因沉默和TaER1BS过表达株系分析结果表明,TaER基因在小麦叶片的发育过程中通过调控小麦叶片的气孔细胞和表皮细胞的大小来调控小麦的光合速率、气孔导度和蒸腾速率,进而影响小麦的单株生物量和单株产量。因此,TaER基因在调控小麦蒸腾效率和光合效率具有重要功能,调控TaER基因可以提高小麦的蒸腾效率和生产潜力,通过检测其表达量可以对小麦蒸腾效率相关指标进行辅助选择。