背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌)是原发性肝癌的主要类型,在全球范围内占恶性肿瘤死亡的第三位。全世界每年一半以上的新发肝癌病例在我国,近20年来HCC发病率呈上升趋势,我国每年约11万人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人数的45%,占全部恶性肿瘤死亡率的18.8%。近年来,随着分子生物技术、病毒学以及遗传学等的快速发展,相关研究普遍认为肝癌的发生是多步骤、多因素、多途径(如p53途径、Rb途径、Wnt途径、ras途径等)长期相互作用的结果。目前已知的导致肝癌发生的相关因素包括外环境的致癌因素如慢性病毒性肝炎(主要是HBV和HCV)、肝硬化、非酒精性脂肪肝、胆管疾病、寄生虫、细菌的感染、黄曲霉毒素B1的摄入、药物及有毒物质、水源污染以及吸烟、饮酒等和一些遗传代谢性疾病如血色素沉积症、抗胰蛋白酶缺乏症。这些先天和后天的改变导致调控细胞生长、分化、凋亡或有丝分裂的细胞传导通路发生变化,从而导致肝脏慢性炎症以及肝细胞再生直接或间接的导致肝癌的发生。肝癌因其起病隐匿、自然病程极短、转移快、死亡率高而严重威胁着人们的健康和生命。目前的研究焦点是在肝癌的分子发病机制基础上寻找新的肿瘤标记物和潜在的靶向治疗方法。发现最早且临床应用最广泛的肝癌血清分子标记物是甲胎蛋白(AFP, a-fetoprotein),但是它诊断肝癌的阳性率大约只有60%,在诊断早期肝癌或小肝癌时阳性率更低。目前尚没有任何一个肝癌标记物能够特异的诊断全部的肝癌,大多是通过联合检测以提高肝癌的检出率。因此,寻找敏感性和特异性更高的肝癌分子标记物对于肝癌的早期诊断及靶向治疗意义重大。人类的WEE1 (WEE1A;WEE1hu)基因编码产物为一种酪氨酸激酶的核蛋白,属于蛋白激酶中丝氨酸/苏氨酸家族的一员。是调控细胞周期G2期阻滞的关键元件,参与了细胞有丝分裂前的DNA复制及损伤修复过程。MCM6(minichromosome maintenance protein 6)是20世纪80年代由Holthoff HP等人在突变的酵母中发现,然后通过分子和生物化学实验方法分离提取出来的。它属于微小染色体维持蛋白MCM家族的一员,存在于所有的真核细胞中。MCM家族还包括其它5个微小染色体维持蛋白(MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM7)。微小染色体维持蛋白6(MCM6)是DNA复制和延伸的关键蛋白,被认为是特异性细胞增殖相关因子。应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)方法和免疫组织化学(Immunohistochemistry)的方法检测人体正常肝脏组织、肝硬化组织和肝癌组织中WEE1基因、MCM6基因转录和蛋白表达水平的差异,探讨二者在肝癌发生、发展过程中的的作用及其与肝癌分化及病理分级的关系。材料与方法1.1材料2010年3月-2010年5月期间于河南省人民医院取得肝脏手术切除标本85例,其中HBsAg阴性的正常肝脏组织23例；HBsAg阳性的肝硬化组织20例；HBsAg阳性的HCC 42例；所有标本的疾病诊断均经病理证实。所取组织新鲜,经过患者知情同意。标本取出后切成小块状迅速置于液氮冷冻待用。1.2方法1.2.1 RT-PCR:按照RNA提取试剂盒(杭州博日公司)说明书提取总RNA；用紫外分光光度计测定总RNA吸光度,以260/280nm比值计算总RNA的纯度；经1%琼脂糖凝胶电泳(180V, 10min)测定总RNA28S和18S亮度比值,评估总RNA的完整性；按照RT-PCR试剂盒(杭州博日公司)步骤进行逆转录聚合酶链式反应；目的基因与内参同管扩增,扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(90V,35min)；应用BIO-RAD Gel Doc XR凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)进行扫描及半定量分析。1.2.2 Western blot按照常规方法提取肝脏组织总蛋白、测蛋白样品浓度、双向凝胶电泳、转膜(WEE1半干转20V,30min; MCM6湿转300mA、2h)、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、ECL化学发光、X片曝光显影、利用Quantity One软件扫描并分析结果。1.2.3将各组肝脏组织标本常规HE染色后进行病理学分级,使用S-P法进行免疫组织化学检测,最终结果由至少三个不同的观察者进行判断,最后用显微扫描成像系统(美国Aperio公司)拍照、储存图片。1.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件对数据进行成组设计资料的单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验、Fisher’s精确检验及Kruskal-Wallis秩和检验的统计学处理,以a=0.05为检验水准。结果1.各组总RNA提取结果良好。电泳结果证实提取的是高纯度RNA,总RNA的吸光度A260/A280值均在1.5-2.0；扩增产物条带清晰。2. RT-PCR mRNA的表达在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中,WEE1mRNA阳性表达率分别为21.7%、55%和90.5%,三组间差异有统计学意义(P<0.01)。正常肝脏与肝癌、肝硬化与肝癌、正常肝脏与肝硬化组差异均有统计学意义(P<0.05)；MCM6mRNA阳性表达率分别为21.73%、20.00%和83.33%。三组间差异有统计学意义(P<0.01)。正常肝脏与肝癌、肝硬化与肝癌差异有统计学意义(P<0.05),正常肝脏与肝硬化组差异无统计学意义(P>0.05)。3. WEE1蛋白的表达Western blot和免疫组织化学方法分别检测正常肝脏、肝硬化、肝癌组织中WEE1蛋白阳性表达率分别为13.04%/17.4%、40%/60%和78.6%/83.3%,三组间相比差异有统计学意义(P<0.01)。肝癌组织中WEE1表达强度与肿瘤的分化程度及病理分级相关。4. MCM6蛋白的表达Western blot检测人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中MCM6蛋白表达阳性率分别为：13.04%、20%、71.43%。三组间差异具有统计学意义(P<0.01)。MCM6高表达与肝癌发生有关(P<0.01)。结论1.WEE1基因在肝癌中呈上调表达,其参与的DNA的修复异常与肝癌的发生密切相关.且与肿瘤的分化程度和病理分级相关。MCM6在肝癌组织中高表达。提示其参与的DNA的复制异常与肝癌的发生相关。2. WEE1可能成为诊断早期肝癌的候选基因,并为肝癌的靶向分子治疗提供生物学依据,MCM6反映了细胞增殖活性,可作为预防、诊断肝癌的一个标记物。