Tc17细胞亚群在ITP中的表达及机制研究原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是临床最为常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。ITP临床表现为皮肤粘膜出血,月经过多,内脏出血,甚至颅内出血,严重影响人类健康。ITP是血小板破坏过多和(或)生成不足共同导致的血小板计数减少。细胞免疫反应异常的机制包括抗原递呈细胞、T细胞和B细胞之间复杂的相互作用。如Thl/Th2细胞亚群失衡,血小板特异性自身反应性T细胞和B细胞的活化,调节性T细胞数量的减少或抑制功能受损,以及细胞毒性T细胞对血小板的破坏等。T细胞异常被认为在ITP发生中起着重要作用。但是,血小板减少症细胞免疫异常的具体机制尚不明确。研究发现,在健康成年个体内,可发现具有潜在自身反应活性的T细胞。许多报道涉及细胞免疫调节机制,如Thl细胞异常,抑制性调节性T细胞比例降低,及细胞毒性T细胞介导的血小板破坏,同时,有研究报道细胞毒性T细胞介导的血小板减少性紫癜动物模型。Th17是新发现的辅助性T细胞亚群,特异性产生IL-17。IL-17被证明在包括类风湿性关节炎,实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),和过敏原特异性反应在内的自身免疫性疾病中起关键作用。在我们前期研究中,利用流式细胞术通过细胞内细胞因子分析,检测了ITP患者和正常对照者外周血Th17水平,首次证明了Th17细胞比例在ITP患者外周血中升高。T-bet是新发现的T-box家族转录因子,选择性地在Thl细胞中表达。作为Th1细胞的特异性转录因子,诱导IFN-γ的产生,并在Thl细胞的分化中起着决定性作用。有研究发现,缺乏T-bet表达的CD8+T细胞向产生IL-17分流。据观察,小鼠体内分泌IL-17的CD8+T细胞存在T-bet缺失,并在移植排斥中发挥作用。最近,一个分泌IL-17的新的CD8+T效应细胞,Tc17细胞亚群受到关注。一项研究表明,Tc17细胞可能是一个不同于分泌IFN-y的CD8+T细胞(Tcl)的亚群。Tc17细胞参与了诸如感染,肿瘤,自身免疫性疾病等多种疾病,Tc17细胞分泌的IL-17,肿瘤坏死因子(TNF),和IFN-y在增强招募T细胞,中性粒细胞和巨噬细胞中起到重要作用。然而,与Th17不同的是,Tcl7细胞亚群只收到少数关注。而且,Tc17的特点和ITP患者Thl7与Tc17之间的关系还没有得到系统的研究。为了进一步研究Tc17细胞在ITP的发病机制中的作用,我们检测了Tc17细胞水平并于Th17细胞水平相比较,以评价其临床相关性。目的：检测ITP患者体内Tc17水平,分析Tcl7与Th17相关性,并利用地塞米松体外干预ITP患者外周单个核细胞,检测Tc17表达变化。通过检测Tc17在ITP外周血中的水平,及地塞米松对其的影响,研究Tcl7在ITP中的作用。方法：◆选择初诊ITP患者46例,正常对照来自于34例健康志愿者。◆流式细胞术检测Tc17和Th17细胞在CD3+T细胞中所占比例。◆提取ITP患者单个核细胞加入地塞米松培养3天,检测培养后的PBMCs中Tc17细胞占CD3+T细胞的比例。◆利用改良的MAIPA技术检测特异性血小板抗体GPⅢb/Ⅲa和GP I b/IX.水平。结果：◆ITP患者T细胞中IL-17的表达与正常对照组相比,Tc17细胞比例在ITP患者T细胞中显著升高(0.79±0.69%vs0.39±0.33%, P<0.001)。同时验证ITP患者和正常对照组Th17细胞有显著差异（2.10±1.33%vs1.40±0.90%,P<0.01)。◆Tc17和Th17的相关性在正常对照外周血中,Tc17和Th17呈正相关关(r=0.7239,P<0.0001,),而在ITP患者外周血中,无相关性(r=0.0817,P=0.590)。◆ITP患者外周血中,Tc17与CD8/CD4比值及CD8+T细胞的相关性与正常对照组(2.10±±0.82)相比较,CD8/CD4比值在ITP患者中下降(1.47±0.91；P=0.029),同时和正常对照组相比较,CD8+细胞百分比(23.99±5.92%)在ITP患者中升高(30.97±12.19%,P=0.025)。Tc17和CD8/CD4比值呈正相关(P=0.001),Tc17和CD8+T细胞呈正相关(P=0.006)。◆在自身抗体阴性的ITP患者外周血中,Tc17有升高趋势和MAIPA阳性的ITP患者外周血Tc17(0.57±0.25%)相比较,MAIPA阴性ITP患者的Tc17水平有升高趋势(1.15±±1.09%,P=0.07)。◆地塞米松对ITP患者PBMCs中Tc17细胞的百分比的影响随着培养液中地塞米松浓度的增加,ITP患者PBMCs中Tc17细胞的百分比降低结论：◆ITP患者外周血中的Tc17比例升高。◆正常人外周血中,Tc17细胞与Th17细胞成正比；而ITP患者外周血中,这两种细胞亚群比例紊乱。◆地塞米松抑制ITP患者PBMCs中Tc17的比例。意义：ITP患者Tc17细胞亚群表达升高,细胞免疫异常是ITP重要发病机制之一。DXM可能提高ITP患者Tc17的比例。Tc17细胞亚群可能在ITP发病中起重要作用,提示阻断IL-17有希望为ITP的治疗提供新思路。Th22细胞亚群在ITP中的表达及机制研究原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是由于机体免疫失耐受,产生的抗血小板自身抗体与血小板表面特异性抗原结合,导致血小板在网状内皮系统过度破坏引起血小板减少。此外,多种细胞免疫机制异常,如Thl极化、调节性T细胞数目降低或者抑制功能缺陷、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的血小板破坏等在ITP的发病中发挥重要作用。到目前为止,出现上述异常的具体原因尚未明确。随着近几年来细胞免疫研究的不断深入,发现了一些新的辅助性T细胞亚群。如Th17细胞亚群、Th9细胞亚群等,通过各种途径在自身免疫性疾病和变应性炎症中发挥作用。Th22细胞的生物学特性通过用二醋酸羧基荧光素(CFSE)标记外周T细胞、边缘区的朗格汉斯细胞(LCs)和树突状细胞(DCs),流式细胞技术分析T细胞的增殖发现,LCs能够诱导初始CD4+T细胞产生IL-22, DCs作用稍弱于朗格汉斯细胞,但同样可以诱导IL-22产生,表明的LCs与DCs都可以诱导初始CD4+T细胞向Th22细胞亚群分化。在这个过程中,几乎没有IL-17产生。并且,Th22细胞的分化可能部分依赖于IL-6和TNF-α的调节作用。Th22细胞是了一种稳定成熟的T细胞亚群,记忆性的Th22细胞不会向其他亚群分化。目前,Th22细胞的调节机制还不完全明确。Th22细胞的调节性与T细胞的调节相似。其主要分泌IL-22细胞因子,IL-1β和TNF-γ能够加强IL-22受体分子表达途径,特别是IL-22R1和STAT-3途径。当机体感染病毒或细菌等病原体后,Th22细胞能和Th17细胞在一些自身免疫性疾病的发病中发挥作用。STAT3是信号传导与转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT)蛋白家族成员。STAT家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白,在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体,保持信号在细胞内传递的内在特异性。Th17细胞的分化也依赖STAT-3和RORC的活化,并受多种细胞因子的调节,包括IL-6, IL-1β,转化生长因子β1(TGF-β1)和IL-23A,以及自分泌产生的IL-21。IL-22是Th22细胞分泌的效应细胞因子,在多种细胞中诱导STAT信号通路的活化。以往研究发现,STAT-1, STAT-3和STAT-5可被IL-22快速强烈的激活。后来的研究表明,其表面受体结合IL-22的大鼠肝癌H4IIE细胞株可快速诱导激活JAK1和TYK2,并继而导致STAT-1, STAT-3和STAT-5的磷酸化。IL-22参与了多种人类某些自身免疫性疾病的发病机制,如类风湿性关节炎(RA),克罗恩病等。迄今还没有研究报告的数据显示Th22细胞亚群(CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+T细胞)和Th17细胞亚群在ITP患者中的情况。为了研究Th22细胞亚群在ITP患者发病机制中的作用,我们检测了Th22细胞,Th17细胞,Th1细胞,血浆IL-22水平和相关转录因子STAT-3和RORC mRNA的相对定量表达。并分析了它们在ITP中的相互关系。目的：检测ITP患者外周血Th22细胞亚群和血浆IL-22水平,分析Th22与Th17、Th1相关性,并检测外周血单个核细胞STAT-3、RORC mRNA的相对定量表达,研究Th22细胞亚群在ITP中的作用。方法：◆选择初诊ITP患者44例,正常对照来自于36例健康志愿者。◆利用流式细胞术检测Th22、Th17和Th1细胞在PBMCs中所占比例。◆酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunoadsorbent assay, ELISA)检测血浆中IL-22细胞因子水平。◆实时定量PCR技术检测相关STAT-3和RORC mRNA水平。结果：◆ITP患者外周血中Th22细胞亚群的百分比与正常对照组(0.73%；0.24-1.56%)相比,Th22细胞比例在ITP患者外周血中显著升高(1.19%；0.1-9.51%,P<0.0001)。◆ITP患者血浆中IL-22细胞因子的水平与正常对照组(9.98±1.06pg/ml)相比,Th22细胞比例在ITP患者外周血中显著升高(13.39±8.33pg/ml; P<0.0001)。◆Th22细胞亚群和IL-22细胞因子的相关性在ITP患者外周血中,Th22细胞亚群和IL-22细胞因子呈正相关(r=0.8457,P<0.001,),而在正常对照组中,二者无相关性(r=0.2253,P=0.3014)。◆ITP患者外周血中,Th22与Th17和Thl细胞的相关性Th22与Th17细胞呈正相关(r=0.7678,P<0.0001),Th22和Thl细胞呈正相关(r=0.6056,P=0.0047),Th17和Thl也呈正相关(r=0.5344,P=0.0126)。◆STAT-3和RORC mRNA在ITP患者外周血中的表达升高STAT-3mRNA在ITP患者中的相对定量表达(1.644；1.164-2.189)比正常对照组(1.584；1.057-1.776；P<0.05)明显升高。RORC mRNA在ITP患者中的相对定量表达(2.502；1.885-2.846)比正常对照组(2.208；1.381-2.886；P<0.05)明显升高。◆在自身抗体阴性的ITP患者外周血中,Th22细胞显著升高和MAIPA阳性的ITP患者外周血Th22(0.83；0.23-1.24)相比较,MAIPA实验阴性ITP患者的Th22水平有升高趋势(2.35; range,0.39-9.51;P=0.013).◆Th22细胞亚群与ITP临床指标无明显相关性Th22细胞亚群百分比和患者外周血血小板计数无显著相关性(r=-0.0849,P=0.493)。结论：◆ITP患者外周血中的Th22细胞百分比升高。◆ITP患者血浆中IL-22细胞因子浓度升高,且与Th22细胞呈正相关。◆转录因子STAT-3和RORC mRNA在ITP患者外周血中的表达升高意义：ITP患者Th22细胞亚群和血浆IL-22浓度都明显升高,在mRNA水平,相关转录因子显著升高,提示Th22参与的细胞免疫异常可能是ITP重要发病机制之一。针对Th22细胞亚群的相关措施有希望为ITP的治疗提供新思路。中和IL-17A和IL-21通过Th17信号传导通路缓解免疫性血小板减少症患者Th17/Treg细胞免疫异常的研究多种细胞免疫机制异常,如Thl极化、调节性T细胞数目降低或者抑制功能缺陷、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的血小板破坏等在ITP的发病中发挥重要作用。到目前为止,出现上述异常的原因尚未明确。调节性T细胞,其在细胞核表达Foxp3,为功能性免疫抑制性T细胞亚群,并在诱导T细胞耐受中发挥关键作用。许多自身免疫性疾病如类风湿性关节炎,I型糖尿病和多发性硬化症与外周血Treg不足有关。许多研究表明,活动性ITP患者Treg细胞缺陷,而导致ITP患者自身免疫耐受功能缺陷。我们以前的研究中也观察到ITP患者的Treg细胞功能和数量的异常。Th17细胞的特点是在人体产生IL-17A (IL-17), IL-17F, IL-21, IL-22和IL-26。IL-21的自分泌,激活STAT3,诱导RORyT是调节Th17细胞系分化的关键点。Th17细胞及其效应细胞因子越来越被认为在炎症,自身免疫性疾病和过敏反应中起着关键作用。Th17细胞已被证明在诱导包括类风湿性关节炎,实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),和过敏原特异性反应在内的自身免疫性疾病中发挥了至关重要的作用。在我们的前期工作中,我们通过流式细胞仪对细胞内细胞因子进行分析,首次证明了Th17细胞在ITP患者外周血中升高。由于Th17和Treg细胞异常参与了ITP的发展过程,通过有效阻断细胞因子将会是调节Th17/Treg失衡并治疗ITP的新策略。Th17通路细胞因子[白介素17A (IL-17A)和白介素21(IL-21)]在我们的前期研究中已被证实在免疫性血小板减少症患者(ITP)外周血中高表达,IL-21与Th17亚群上调呈正相关,提示IL-17A和IL-21可能在ITP中发挥作用。然而,IL-17A和IL-21在ITP中的作用尚不明确。目的：为了进一步研究他们在ITP发病中的作用,我们用IL-17A, IL-21及其抗体干预并观察它们对增殖、凋亡、Th17和调节性T细胞(Treg)的作用。检测干预后ITP患者和正常对照组单个核细胞STAT1, STAT3, STAT5,和RORC表达,寻求IL-17A和IL-21细胞因子在ITP患者外周血中的作用及机制。方法：◆用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离25个ITP患者及21个健康人外周血单个核细胞(PBMCs),同时用免疫磁珠分选29个ITP患者及20个健康人的外周血CD3+T细胞。◆PBMCs或CD3+T细胞分四个实验组(分别用IL-17A, IL-21, IL-17A抗体,IL-21抗体干预)和1个对照组。PBMCs各组同时用IL-2维持细胞分化生长,CD3+T细胞各组同时用CD3/CD28单克隆抗体维持,都在37-C,5%C02条件下孵育72小时。◆用CCK8法检测细胞增殖。◆用流式细胞术检测细胞凋亡率、Th17及Treg细胞比例。◆应用ELISA测定IL-17A (IL-17A抗体)组上清培养液中的IL-21和IL-21(IL-21抗体)组上清培养液中IL-17A的浓度。◆利用实时定量-聚合酶链反应(QT-PCR)测定RORC, STAT-1, STAT-3and STAT-5mRNA的表达。结果：◆ITP患者标本经IL-17A或IL-21干预培养后：a.Th17百分比升高(2.09±2.18%或1.70±1.20%vs1.57±1.53%)；b. Treg百分比降低(5.69±3.01%或5.69±2.09%vs6.19±2.76%)；c.凋亡率降低(5.24±4.39%或5.05±4.59%vs6.48±5.59%)。◆经IL-17A抗体或IL-21抗体干预后：a.Th17百分比降低(1.21±1.27%or1.38±1.18%vs1.57±1.53%)；b. Treg百分比升高(6.82±3.00%or6.67±3.01%vs6.19±2.76%)；c.凋亡率升高(6.67±5.39%or6.78±4.90%vs6.48±5.59%)。◆而在健康人中未发现类似结果。◆在ITP患者和健康人中,各组增殖率未见显著性差异(P>0.05)。◆有趣的是,CD3+T细胞在CD3/CD28单克隆抗体(或IL-2)及干预因子条件下经过72小时培养后,通过流式细胞术检测不到Th17细胞亚群。◆与其他研究不同的是,我们意外发现ITP患者PBMCs或CD3+T细胞中的Treg亚群分别经IL-2(6.25±3.39%vs5.884±2.05%)或CD3/CD28单克隆抗体(6.08±1.15%vs5.944±1.97%)体外培养72小时后,其百分比与健康人组相比未见显著性差异。◆IL-21干预组升高ITP患者IL-17A细胞因子的浓度。◆与正常对照相比,在ITP患者PBMCs中,IL-17A升高STAT1, STAT3,而没有升高RORC or STAT-5,同时IL-21促进STAT-1, STAT-3, STAT-5, RORC mRNA的转录。◆IL-17A单克隆抗体降低RORC, STAT-1转录,同时上调STAT-3和STAT-5,同时IL-21单克隆抗体上调RORC, STAT-3,下调STAT-1mRNA的转录。结论：◆中和Th17通路细胞因子下调Th17亚群,上调Treg亚群和T细胞凋亡率,提示Th17通路细胞因子在ITP的免疫异常的发病机制中起着一定作用。◆该研究还提示,体外Th17的正常分化需要PBMCs中除CD3+T细胞之外其他细胞的存在。◆较之健康对照组,IL-2在ITP患者PBMCs中有更明显的升高Treg的作用。意义：◆Treg/Th17细胞在ITP免疫异常机制中发挥一定作用。◆调节IL-17, IL-21的效应机制或可作为ITP一个新的治疗靶点,为ITP治疗提供新的理论依据和实验基础。