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鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)的功能蛋白VP3可单独激发细胞凋亡过程。因此，也被称为凋亡素(Apoptin)。研究表明，凋亡素能选择性诱导人肺癌细胞、黑色素癌细胞、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞凋亡，并且对正常二倍体体细胞无作用，被认为是第一个真正意义上可选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。然而，天然状态下的 Apoptin很难透过细胞膜屏障诱导肿瘤细胞凋亡，HIV-1的反式激活因子TAT具有跨膜功能，能高效快速地跨膜转运与之融合表达的蛋白并使之进入细胞，对细胞无损伤；此外，减毒鼠伤寒沙门菌可作为肿瘤基因治疗的载体，能够选择性聚集在肿瘤组织，并且安全、可靠。 因此，本研究利用减毒鼠伤寒沙门菌载体平衡系统构建能稳定携带TAT-Apoptin基因的重组菌株?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)，感染小鼠黑色素瘤细胞B16F10和小鼠肺癌细胞LL/2后观察分析其抗肿瘤作用，不仅可望为鼠伤寒沙门菌携带 Apoptin的体内抗肿瘤机制提供一定的理论基础，更重要的是可为Apoptin在肿瘤治疗与应用提供新的思路与途径。主要研究内容包括： 1.改良型TAT-Apoptin基因的克隆与鉴定 以 CAV全基因组为模板，利用 Apoptin引物先扩增出378bp左右的目的片段，连接至pMD19-T，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落，扩大培养后提质粒，用限制性内切酶EcoR I和Sal I对重组载体pMD19-T-Apoptin进行双酶切鉴定，电泳可见3000bp左右的载体条带和约为378bp大小的Apoptin目的条带；再以构建好的 pMD19-T-Apoptin为模板，利用 TAT-Apoptin引物成功扩增出411bp左右的TAT-Apoptin融合基因片段，并成功构建了重组载体pMD19-T-TAT-Apoptin。对克隆片段进行序列测定及分析后，结果显示重组载体pMD19-T-TAT-Apoptin包含完整的Apoptin基因及TAT序列，其中Apoptin基因序列与GenBank（AF199501）中发表的鸡贫血病毒CAV基因序列相比同源性为99.7％。但氨基酸序列同源性为100%。 2.携带 TAT-Apoptin重组减毒鼠伤寒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)的构建及其生物学特性 为构建能稳定携带TAT-Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌，分别用EcoR I和Sal I对pMD19-T-TAT-Apoptin和pYA3493进行双酶切，将所得目的片段进行连接，转化至大肠杆菌χ6097，挑取单菌落进行PCR和酶切鉴定，并测序；然后将鉴定正确的阳性重组质粒 pYA3493-TAT-Apoptin电转化至减毒鼠伤寒沙门菌?crp?asdSL1344，并对该重组减毒沙门菌生长特性、遗传稳定性和表达特性进行分析。PCR和测序表明，成功构建重组载体pYA3493-TAT-Apoptin，进一步对重组减毒鼠伤寒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)研究发现，其生长速度与强毒株 SL1344相比明显减慢，与缺失株?crp?asdSL1344及互补菌株?crp?asdSL1344(pYA3493)基本一致，且能够稳定遗传TAT-Apoptin基因，重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到TAT-Apoptin蛋白条带。以上结果证明，能稳定携带 TAT-Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)构建成功，且该重组菌能分泌性表达TAT-Apoptin蛋白，进一步为减毒鼠伤寒沙门菌携带Apoptin的抗肿瘤作用研究奠定一定的基础。 3.重组减毒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)对肿瘤细胞的作用 将构建好的能稳定携带 TAT-Apoptin的重组减毒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)体外感染黑色素瘤细胞B16F10和肺癌细胞LL/2，利用Western-blot检测TAT-Apoptin在不同肿瘤细胞内的表达情况，CCK-8法检测不同MOI及感染时间条件下细胞增殖情况，流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡情况，并进一步分析Caspase-1,3,6,8,9和细胞色素C等信号蛋白的表达情况。Western-blot结果显示，重组菌感染B16F10和LL/2细胞后，可在细胞内检测到约20KD的TAT-Apoptin蛋白条带；CCK-8法实验结果表明，MOI浓度越大，抑制率越高，并且随着感染时间的增加，抑制率逐渐下降，说明重组减毒鼠伤寒沙门菌抑制B16F10和LL/2细胞增殖具有浓度依赖性和时间依赖性；重组减毒鼠伤寒沙门菌感染B16F10、LL/2细胞24h后，荧光显微镜下可观察到TUNEL阳性细胞；AnnexinV/PI流式细胞术结果发现，重组减毒鼠伤寒沙门菌感染B16F10细胞后，12h时AnnexinV+/PI+阳性率为18.3%，24h时为23.2%，感染LL/2细胞后12h，AnnexinV+/PI+阳性率可达到52.2%，24h时为39.0%，均明显高于对照组细胞，这表明重组减毒鼠伤寒沙门菌能够诱导B16F10和LL/2细胞凋亡；进一步对凋亡信号蛋白分析发现，重组菌感染肿瘤细胞 B16F10和 LL/2后，能诱导Caspase-3，Caspase-6，Caspase-8，Caspase-9和细胞色素C的表达，互补菌对照组和细胞培养空白组均不能诱导上述信号蛋白的表达，此外Caspase-1在LL/2细胞中表达显著升高，以上结果表明，重组减毒鼠伤寒沙门菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)能够有效递呈 TAT-Apoptin基因在黑色素瘤细胞 B16F10和肺癌细胞LL/2内表达，且能够诱导这两种肿瘤细胞凋亡，其可能通过外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡，并且诱导肺癌细胞LL/2凋亡还与炎症相关因子Caspase-1的介导有关。