肺癌是目前世界上最流行的恶性肿瘤之一，死亡率位居癌症中的前列。无论是小细胞肺癌还是非小细胞肺癌，其治疗和预后与其临床分期密切相关，大约75%的肺癌病人在初始诊断时就已经处于晚期，所适合的治疗手段严重受限。因此，有效的治疗手段是目前所迫切需求的，而肿瘤疫苗则展现出一个光明的途径。有效的肿瘤疫苗应含有肿瘤细胞确定表达的肿瘤相关抗原。然而，肿瘤疫苗的设计常因此受到一定限制，因为肿瘤细胞表达抗原的种类及数量常常是变化的,而目前人们所发现的肺癌细胞所表达的肿瘤相关抗原的数量是有限的。肿瘤细胞裂解物(Tumor cell lysates, TCL)是通过物理或化学的方法将肿瘤细胞破坏，从而形成的一种含有多种已知或未知肿瘤抗原肽的混合物。尽管肿瘤细胞裂解物抗原并没有完全鉴定，但其提供了肿瘤细胞的全部抗原，可成为制备肿瘤疫苗的良好选择，因为它无需去鉴定每个病人肺癌组织所表达的特异性抗原就可能诱导针对多种肿瘤相关抗原的免疫反应。TCL能够被抗原提呈细胞上的MHC-I类分子或MHC-II类分子识别，并呈递给T细胞。然而，TCL的免疫原性较差，单独应用不能引起有效的抗肿瘤免疫反应。为了提高其免疫原性，高效的佐剂是必不可少的。作为肿瘤疫苗的佐剂，应具备毒副作用低的特点，能够激发免疫系统对较弱抗原产生较强的持久的免疫反应，并能克服一系列的免疫耐受机制，促进诱导能够裂解肿瘤细胞的细胞毒性T细胞的产生。西咪替丁（Cimetidine,CIM）是组胺2受体（Histamine receptor2, H2R）拮抗剂，通过与免疫细胞上的H2R受体作用产生免疫调节作用，主要机制包括：降低抑制性T淋巴细胞的活性，增强自然杀伤细胞（Nature Killer cell，NK）的活性，刺激白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等细胞因子的产生，增强树突状细胞的抗原提呈能力等。因此，CIM具有成为肿瘤疫苗佐剂的潜质。目前，用于肺癌肿瘤疫苗研究的动物模型为皮下移植瘤模型，而肺癌的原位移植模型能够提供肿瘤在体内发展的微环境，能更有利的验证肿瘤疫苗的有效性。本研究在肺癌的原位移植模型上验证了TCL联合CIM对Lewis肺癌的作用效果。本实验组前期研究了TCL联合结核分枝杆菌热休克蛋白65（mycobacterial heat shock protein65，MHSP65）在肺癌皮下模型上具有良好的抗癌效果，我们在肺癌的原位移植模型上重新进行了验证。1.TCL的制备及鉴定我们采取-70℃和37℃间反复冻融法将Lewis肺癌细胞制备成TCL，结果显示Lewis肺癌细胞经过反复冻融后全部遭到了破坏，显微镜下观察可发现全部被台盼蓝染成蓝色，SDS-PAGE结果表明细胞内的蛋白物质已经全部释放，2×107/ml TCL中的蛋白浓度约7.54mg/ml，因此Lewis肺癌细胞经过反复冻融5次所制备的TCL，其内已无细胞存活，且所含肿瘤抗原成分丰富，符合用于后续的实验研究的要求。2.肺癌原位移植模型的建立通过胸壁小切口将Lewis肺癌细胞经肋间肌注入左肺成功的建立了肺癌原位移植模型，手术操作简单，小鼠死亡率低。我们将39只小鼠平均分成3组，接种不同剂量的肺癌细胞：第1组接种1×105/只；第2组接种1×104/只；第3组接种1×103/只。荷瘤后第7天每组解剖3只，三组出瘤率分别为：100%，66.7%，0%。第14天每组解剖3只，出瘤率分别为：100%，100%，66.7%。第32天处死尚存活的小鼠并作生存分析，其中第1组荷瘤后生存时间是17-24天，平均生存期为20.6±0.8天。第2组首只小鼠死亡时间是荷瘤后第27天，至第32天时共有4只小鼠死亡，生存期较第1组显著延长（P<0.001），余3只小鼠处死后左肺可见肿瘤。第3组小鼠无死亡，生存期较第1组（P<0.001）及第2组（P=0.022）均显著延长，处死小鼠后发现5只小鼠左肺可见肿瘤，2只未成瘤，提示接种较低剂量的肿瘤细胞其生存期延长，但出瘤率将下降。后续实验模型选择的接种细胞数为5×103/只。我们对小鼠体重定期称量，发现第1组7只模型小鼠在死亡前一天的体重较荷瘤后第4天的体重明显下降（P=0.042）。因此，模型的体重变化可作为监测小鼠死亡的可靠指标。3.TCL联合CIM对小鼠Lewis肺癌的作用我们于第0天通过向胸腔注射Lewis肺癌细胞5×103/只建立了小鼠原位肿瘤移植模型，同时应用2种组合方式来验证同一CIM剂量下不同CIM注射频率所产生的抑瘤效果:第一种组合为PBS，TCL，CIM，TCL-CIM（TCL与CIM混合物）组，于-7，1，8，15天免疫；第二种组合为PBS，TCL,CIMDaily，TCL-CIM Daily，于-7，1，8，15天免疫PBS，TCL，CIM，TCL-CIM，除上述四天外CIM Daily组与TCL-CIM Daily组在-7至21天内其余每天均注射CIM。此外还在第一种组合基础上探讨一种主动免疫联合过继免疫治疗方法（TCL-CIM-SP组）：TCL-CIM于-7，1，8，15天免疫，将TCL-CIM刺激的脾细胞于6，13天经已免小鼠尾静脉回输。实验结果如下：第一种组合共分PBS，TCL，CIM，TCL-CIM四组，荷瘤后第21天处死部分小鼠后发现CIM组肿瘤平均直径明显小于PBS组（P=0.044）及TCL组（P=0.024）。生存分析显示CIM组小鼠较PBS组（p=0.021）及TCL组（p=0.029）生存期明显延长，而TCL-CIM组较其他三组均未见明显的生存期延长（P>0.05）。第二种组合共分PBS，TCL，CIM Daily，TCL-CIM Daily四组，荷瘤后第21天处死部分小鼠后发现CIM Daily组（P=0.004vs PBS；P=0.003vsTCL）与TCL-CIM Daily组（P=0.004vs PBS；P=0.003vs TCL）肿瘤直径明显小于PBS组及TCL组，但该两组之间无明显差异（P>0.05）。生存分析显示CIM Daily组小鼠较PBS组（p<0.001）及TCL组（p<0.001）生存期显著延长，TCL-CIM Daily组较PBS组（p=0.003）及TCL组（p=0.005）生存期显著延长，但TCL-CIM Daily组生存期与CIM Daily组相比较未见明显差异（P>0.05）。综合以上两组实验结果可以得出CIM不适合作为TCL的佐剂，但其单独应用具有体内抑瘤作用。研究发现CIM组生存期较PBS组延长（P=0.021），而CIM Daily组生存期较PBS组（P<0.001）及CIM组（P=0.01）显著延长，相同剂量的CIM，应用频率的增加可使效果更突出。将荷瘤后第21天处死小鼠的左侧肺脏取出，并用HE染色制备病理切片。肿瘤组织病理切片结果显示：CIM Daily组与TCL-CIM Daily组肿瘤核心区域可见小范围的坏死组织，并有少量的淋巴细胞浸润。提示每天注射CIM能够引起肿瘤细胞凋亡及淋巴细胞浸润。为验证不同浓度的CIM体外能否直接抑制Lewis肺癌细胞增殖，我们用MTT法于刺激后48小时后检测其OD值，计算Lewis肺癌细胞的活力指数（实验组OD值/对照组OD值）×100%。结果显示CIM能够抑制Lewis肺癌细胞的增殖，具有剂量依赖性。为验证CIM能否活化小鼠脾脏内NK细胞，我们将小鼠分为3组：PBS组、CIM组（每周注射一次CIM）、CIM Daily组（每天注射CIM）。其中PBS组和CIM组于第0、7、14天免疫小鼠，CIM Daily组每天均注射CIM。第18天处死小鼠并取脾制备脾细胞悬液，用流式细胞术检测NK细胞的分子标记。结果所示：CIM Daily组相对于PBS对照组能够明显活化NK细胞（P=0.016），而CIM组则对NK细胞无明显活化（P>0.05vs PBS）。CIMDaily组较CIM组能够更好的刺激NK细胞的增殖（P=0.025），说明同一剂量的CIM，注射频率的增加与NK细胞的活化呈正相关性，CIM能够增强C57BL/6小鼠的天然免疫反应。我们在第一种组合PBS组与TCL-CIM组基础上增加了TCL-CIM-SP组抑瘤实验(TCL-CIM免疫联合TCL-CIM体外刺激后的脾细胞的回输)。尽管TCL-CIM组生存期较PBS组未见明显延长（P>0.05），但TCL-CIM-SP组生存期较PBS组明显延长（P=0.037）。提示肿瘤疫苗联合过继免疫治疗Lewis肺癌可能会取得更好的疗效。4.TCL-MHSP65小鼠体内抑瘤效果将40只小鼠分为PBS，TCL，MHSP65，TCL-MHSP6（5TCL与MHSP65混合物）四组并于-7，1，8，15天免疫，并在第0天通过向胸腔注射Lewis肺癌细胞5×103/只建立了小鼠原位肿瘤移植模型，实验结果显示MHSP65单独应用其生存期较PBS组无显著延长（P>0.05），TCL-MHSP65能够明显延长荷瘤小鼠的生存期（P<0.05）。综上所述，应用反复冻融法所制备的TCL达到了实验应用的标准。而Lewis肺癌原位移植模型的建立方法简单、可靠，为肿瘤疫苗的研究提供了良好的实验平台。TCL联合CIM的体内抑瘤实验表明CIM作为TCL的佐剂不能引起明显的抗肿瘤效果，但单独应用西咪替丁效果显著，这同样为治疗肺癌打开了一个新的途径。TCL-MHSP65抗肺癌的有效性在肺癌原位移植模型得到再次认证，为其进行临床实验增添了更加充分的依据。总之CIM与TCL-MHSP65可能为肺癌患者带来新的希望。