【摘 要】
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本研究利用已构建好的rhKD/APP表达载体,在其活性中心处设计两个酶切位点,（ApaI ,SacII）,实现了人KD/APP的活性中心RAM与BPTI的活性中心KAR的替换,构建了rhKD/APPvar表达载体。电转化毕赤酵母X-33后,成功地将重组质粒转化到酵母菌中并使hKD/APPvar获得高效表达。hKD/APPvar的表达量为285 mg·L-1;在80L发酵罐中,pH3.5条件下,40
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本研究利用已构建好的rhKD/APP表达载体,在其活性中心处设计两个酶切位点,（ApaI ,SacII）,实现了人KD/APP的活性中心RAM与BPTI的活性中心KAR的替换,构建了rhKD/APPvar表达载体。电转化毕赤酵母X-33后,成功地将重组质粒转化到酵母菌中并使hKD/APPvar获得高效表达。hKD/APPvar的表达量为285 mg·L-1;在80L发酵罐中,pH3.5条件下,40升FM21培养基,转数:700rpm?min-1,纯氧浓度为20%～30%,罐内压力为10psi,甲醇添加速率为420mL?h-1,发酵36h,得到产量为750mg?L-1的rhKD/APPvar,成功的实现了rhKD/APPvar在毕赤酵母中高效大规模发酵。本实验建立大鼠慢性CCl4肝损伤的动物模型,观察rhKD/APPvar对CCl4肝损伤大鼠血清酶及肝脏组织病理变化的影响,同时与BPTI和rhKD/APP中剂量组进行了比较。结果表明rhKD/APPvar各剂量组大鼠血清ALT、AST均降低,肝脏组织病理损伤得到明显改善,且呈明显的量效关系。rhKD/APPvar可显著降低慢性肝损伤大鼠血清中ALT、AST及肝组织Hyp含量,抑制ALB和（A/G）比值的降低,减轻肝组织纤维化程度,说明rhKD/APPvar对CCl4所致大鼠慢性肝损伤和肝纤维化具有保护作用。本实验的创新之处在于:⑴构建和克隆高效分泌表达rhKD/APPvar的毕氏酵母工程菌;⑵建立大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺;⑶通过建立慢性肝损伤的动物模型,观察了rhKD/APPvar在慢性肝损伤中的保护作用。
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