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食管癌是一种多种因素参与、多个阶段发展的环境相关性肿瘤。肿瘤细胞具有较强的增殖及抗凋亡能力,在其发生发展的过程中,经常伴随着上皮间质性转化的发生,促进了细胞侵袭迁移等恶性表征。在认识食管癌复杂病因的过程中,环境危险因素一直备受关注,其中亚硝胺类物质暴露是较早确定的危险因素之一;越来越多证据表明HPV也可能在食管癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。课题组前期研究结果表明,淮安地区食管癌与HPV18型感染具有一定的相关性,该地区也存在一定的亚硝胺暴露风险。本研究基于前期的研究结果,以Het-1A细胞为靶细胞,通过转染HPV18 E6、E7基因,和MNNG暴露,建立二者联合作用诱导细胞恶性转化模型,应用软琼脂克隆形成及裸鼠成瘤试验进行验证;同时观察不同暴露条件下细胞形态、增殖、凋亡、侵袭迁移等生物学功能的改变及其相关蛋白的表达,初步探讨HPV与MNNG联合作用致Het-1A细胞恶性转化的可能分子机制。一、HPV18与MNNG联合作用致Het-1A恶性转化的模型建立及相关功能蛋白表达1.HPV18与MNNG联合作用致Het-1A恶性转化的模型建立(1)以Het-1A细胞为靶细胞,根据作用因素的不同将细胞分为四组,分别是HPV18与MNNG联合作用组、HPV18单独作用组、MNNG单独染毒组和空载体对照组,MNNG染毒浓度为2μmol/L。细胞形态学观察发现,随着MNNG染毒时间的增加,HPV+MNNG组与MNNG组细胞形态发生了明显的改变,细胞体积变大、松散、细长、伴伪足,与对照组有明显差异。(2)CCK8检测细胞增殖活力结果显示,HPV+MNNG组和MNNG组细胞增殖呈阶段性变化,随着染毒时间的延长呈现先刺激生长、再抑制增殖最后增殖失控的趋势。联合作用下细胞对毒物的敏感性强于MNNG单独作用组,且增殖率变化较MNNG组更明显。(3)流式细胞术检测细胞周期分布同样呈现阶段性改变,染毒过程中两组细胞均出现周期阻滞,恶转后HPV+MNNG组增殖指数PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)高于MNNG组(P<0.05)。结果显示HPV可影响细胞周期,促进DNA的合成和有丝分裂,协同促进细胞增殖的作用。(4)细胞凋亡双染法检测结果显示,在细胞恶性转化的过程中,细胞在MNNG作用下凋亡率先增加再降低,且HPV+MNNG组细胞的凋亡率改变与MNNG单独作用总体趋势一致,但是变化更加明显,HPV+MNNG组细胞培养至35代后抗凋亡能力与MNNG组相比显著增强(P<0.05)。(5)Transwell小室实验结果显示,HPV+MNNG组及MNNG组细胞培养至35代后侵袭迁移能力与对照组相比显著提高(P<0.05),且HPV+MNNG组细胞的侵袭迁移能力与MNNG组相比增强(P<0.05)。(6)软琼脂集落形成试验及裸鼠成瘤试验结果显示,HPV与MNNG联合作用组与MNNG单独作用组均可形成明显阳性克隆(每个集落的细胞数>50),表明HPV与MNNG联合作用及MNNG单独作用诱导的细胞具备非锚定独立性生长能力。裸鼠成瘤试验显示上述两组细胞接种裸鼠成瘤率均为100%,且两组裸鼠瘤体大小无明显差异(P>0.05),瘤体组织病理学观察均发现类似肿瘤样特征。结果表明HPV与MNNG联合作用组与MNNG单独作用组细胞培养至35代均发生了恶性转化,具备了裸鼠体内致瘤的能力。2.HPV18与MNNG联合作用致Het-1A细胞恶性转化过程中功能相关蛋白表达在细胞发生恶性转化过程中,周期、凋亡、间质性转化及自噬等过程发挥着重要的作用,影响肿瘤的发生发展,也是肿瘤机制研究的主要关注点。在观察细胞功能变化的基础上,对恶转过程中肿瘤相关蛋白进行检测,为HPV与MNNG联合作用诱导Het-1A细胞恶性转化的机制研究奠定基础。(1)在细胞恶性转化的过程中,HPV+MNNG组细胞周期相关蛋白cyclinD1表达先抑制再增加,且细胞培养至35代,cyclinD1蛋白表达高于MNNG单独作用组;HPV+MNNG组和MNNG单独染毒组c-Myc蛋白表达随着染毒代数的增加而增加,且HPV转染细胞中该蛋白表达明显增强。(2)HPV与MNNG的联合作用下发生恶转的Het-1A细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显高于对照组,且HPV单独作用组细胞抗凋亡能力与对照组相比增强。各组细胞凋亡蛋白Bax均随着代数的增加呈现增加的趋势,可能是随着代数的变化细胞衰老造成的。细胞在HPV与MNNG的联合作用下抗凋亡能力与MNNG单独作用组相比增强。(3)HPV+MNNG组与MNNG组细胞间质性转化相关蛋白E-cadherin表达水平随着染毒代数的增加而降低,N-cadherin蛋白表达与染毒初期相比明显增强,但两组差异不明显。四组细胞间质性转化水平在培养过程中均发生了变化。结合细胞侵袭迁移试验结果,间质性转化的水平对细胞侵袭迁移能力有重要的影响。(4)联合作用组细胞培养至35代,P62过表达,自噬流阻滞;mTOR蛋白表达先减少后增加,但仍低于对照组,而LC3II蛋白表达与对照组相比增加,表明HPV与MNNG联合作用初始阶段刺激自噬的发生,但随着P62表达的累积,自噬流阻滞,自噬功能受损。二、HPV18与MNNG联合作用致Het-1A细胞恶性转化的机制研究1.P62基因在HPV18联合MNNG致Het-1A细胞恶性转化的作用免疫印迹试验(Western blot)结果表明Het-1A细胞在恶性转化的过程中自噬相关蛋白P62表达异常,通过敲除P62基因,检测细胞的生物学功能改变及相关功能蛋白的表达。转染siRNA P62使恶性转化HPV+MNNG组细胞增殖能力减弱,细胞周期出现明显阻滞,cyclin D1蛋白表达明显下调,c-Myc蛋白表达上调;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调且Bax表达上调;自噬相关蛋白LC3II表达增多,Beclin1蛋白表达增多,P62显著降低。细胞凋亡率和自噬水平增加,细胞抗肿瘤的能力减弱。且PI3K/AKT信号通路随着P62基因表达的抑制而出现明显阻滞。2.HPV18与MNNG联合作用细胞中P62对mTOR的影响HPV单独作用使Het-1A细胞中mTOR与P62蛋白表达上调。P62基因与mTOR表达关系密切,HPV转染的Het-1A细胞中敲除P62基因导致mTOR表达减少,自噬功能增强;敲除HPV与MNNG联合作用下恶转的Het-1A细胞中过表达的P62基因,mTOR蛋白表达减少,Beclin1与LC3II蛋白表达增多,自噬水平增加。3.P62/Keap1/NRF2信号通路在Het-1A细胞恶性转化中的作用机制氧化应激是肿瘤发生发展过程中的重要环节,P62表达异常对细胞氧化应激能力的改变具有重要意义。过表达的P62可能通过激活清除ROS的NRF2抗氧化系统,增强肿瘤细胞的抗氧化能力,促进肿瘤的发展。Western blot检测发现HPV与MNNG联合作用下恶性转化细胞的核蛋白中NRF2表达与MNNG单独作用组相比表达较高,且联合作用组NRF2基因及其下游抗氧化基因NQO1、HO-1 mRNA表达高于MNNG单独作用组(P<0.05),联合作用组抗氧化能力强于MNNG作用组。抑制联合作用组恶性转化细胞中P62基因的表达,细胞核中NRF2蛋白明显减少,NRF2基因表达及下游NQO1、HO-1等下游抗氧化基因的mRNA水平表达明显降低(P<0.05)。通过纳米簇原位合成法检测细胞的氧化损伤程度发现,抑制P62基因表达导致细胞内聚积的纳米簇荧光强度增加,细胞的抗氧化能力减弱。免疫共沉淀验证P62和Keap1蛋白相互作用,结果表明HPV与MNNG联合作用下恶性转化的Het-1A细胞可通过P62-Keap1-NRF2信号通路发挥抗氧化作用,高表达的P62蛋白通过与Keap1竞争性结合,促使NRF2持续活化,使恶转的Het-1A细胞获得更强的抗氧化能力,促进肿瘤的发展。4.PI3K/AKT信号通路在Het-1A细胞恶性转化中的作用机制经典通路PI3K/AKT在多种肿瘤中发挥作用,参与细胞增殖、周期、凋亡、间质性转化等多个过程的调控。本研究中Het-1A细胞在HPV与MNNG的联合作用下,上述生物学功能都观察到明显改变,且PI3K/AKT通路相关蛋白在恶转过程中变化明显,PI3K/AKT通路可能在HPV与MNNG联合作用致Het-1A细胞恶性转化过程中发挥促进作用。PI3K抑制剂LY294002分别以浓度0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,50μmol/L作用于HPV与MNNG联合作用的恶性转化细胞,细胞生长抑制率随着LY294002浓度的增加而增加(P<0.05),但抑制率的增幅随着LY40029浓度的增加而降低(P<0.05)。20μmol/L LY294002作用于恶转细胞,细胞周期明显阻滞,G1期增加(P<0.05),减慢了周期的进程;细胞凋亡率增加(P<0.05)。LY294002的干预使细胞中cyclinD1蛋白、P21蛋白表达水平下调,流式细胞术检测细胞周期出现阻滞,LY294002阻碍了细胞周期的进展,抑制了细胞的增殖;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,Annexin-V APCPI双染法检测细胞的凋亡率增加;E-cadherin蛋白表达与对照组相比增多,N-cadherin蛋白表达明显减弱,snail蛋白表达略增高,表明PI3K通路的抑制导致细胞间质性转化程度降低;LC3II蛋白表达增多,P62蛋白减少,细胞自噬程度增高。在LY294002作用下,PI3K/AKT通路上相关蛋白PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白表达均下调,PTEN蛋白表达在该通路抑制后出现了上调。表明该条信号通路可能在HPV与MNNG联合作用致Het-1A细胞发生恶性转化中发挥重要的调控作用,影响细胞恶性转化的进程。三、主要结论1.HPV与MNNG联合作用能够促进Het-1A细胞的恶性转化,HPV发挥协同促癌的作用,加快了细胞恶性转化的进程。2.P62基因的表达能够影响HPV联合MNNG致Het-1A细胞恶性转化进程。抑制P62基因能够引起细胞增殖减弱,周期阻滞,细胞凋亡率增加,且细胞氧化损伤的程度增加,抗氧化能力减弱。3.HPV转染使Het-1A细胞P62与mTOR蛋白表达上调,mTOR蛋白表达与P62表达成正比,通过干预P62基因表达能够调控mTOR相关信号通路。4.HPV与MNNG联合作用中,恶性转化的Het-1A细胞P62蛋白高表达,通过激活P62/Keap1/NRF2信号通路增加了抗氧化基因HO-1及NQO-1转录,增强了癌细胞抗氧化的能力,进一步促进了肿瘤的发生发展。5.PI3K抑制剂LY294002的作用下,恶转的Het-1A细胞的增殖出现抑制、周期发生阻滞、凋亡水平增加,且相关功能蛋白也发生了明显的改变。PI3K/AKT信号通路的阻断能够抑制肿瘤细胞的发展,减弱细胞的抗凋亡能力。