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拟态弧菌(Vibrio mimicus)是引起水产养殖鱼类弧菌病的肠道病原菌。我们前期研究中以鱼类恒定链类似蛋白与大肠杆菌DH5α菌蜕作为内、外靶向载体构建了拟态弧菌双靶向核酸疫苗,经草鱼口灌免疫试验证实该疫苗可明显增强肠黏膜免疫水平。但是,肠黏膜免疫增强作用的分子调控机制仍不清楚。口服疫苗的免疫效果主要依赖于肠黏膜免疫水平。研究表明硬骨鱼类肠道黏膜层分布着大量免疫细胞和免疫分子,发挥着肠黏膜免疫作用。然而,由于鱼类品种繁多、生理特性复杂多变,又缺乏通用的标识性检测抗体,使得鱼类肠黏膜免疫应答调控机制的研究进展较为缓慢。近年来,随着蛋白质组学技术的快速发展,尤其是iTRAQ技术的引入,为鱼类肠黏膜免疫研究提供了新思路和新方法。本文在制备拟态弧菌双靶向核酸疫苗的基础上,以草鱼为试验对象,利用基于质谱的iTRAQ技术开展疫苗免疫前后草鱼肠组织的差异蛋白质组学研究,以期挖掘出免疫相关的关键差异表达蛋白及其富集的免疫相关通路,并制备关键差异表达蛋白的特异性抗体。完成的主要研究工作和成果总结如下:1)拟态弧双靶向核酸疫苗的制备。本文按照本实验室曹际所建立的方法,先制备大肠杆菌DH5α菌蜕,然后抽提拟态弧菌内靶向核酸疫苗(pcDNA3.1-Iclp-OVepis),最后采用膜囊法将pcDNA3.1-Iclp-OVepis装载到DH5α菌蜕内,获得拟态弧菌双靶向核酸疫苗,可用于后续草鱼免疫。2)草鱼免疫、采样及肠组织总蛋白提取。本文用拟态弧菌双靶向核酸疫苗口灌免疫实验草鱼二次,于免疫后第21 d分别从免疫组与PBS对照组(作为免疫前对照)各随机取9尾鱼,采集中后段肠管,3尾鱼肠管混合成一份样品,每一组共3份样品。采用丙酮沉淀法提取各肠组织样品中的总蛋白,通过SDS-PAGE和BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白的提取效果。结果显示各肠组织样品中总蛋白浓度在12-15 mg/mL之间、蛋白总量介于6100-6600 μg之间,且蛋白条带清晰、完整,可用于后续蛋白组学研究。3)免疫前后草鱼肠组织差异蛋白组学分析。本文利用基于质谱的iTRAQ技术鉴定与定量免疫前后草鱼肠组织中蛋白质,筛选差异表达蛋白(DEPs),并对其进行MRM验证与生物信息学分析。结果共鉴定和定量到11949条肽段和4249个蛋白,其中DEPs 1173个,上调DEPs 629个,下调DEPs 544个,免疫相关DEPs 140个。7个随机挑选的DEPs的MRM验证结果与iTRAQ定量结果的相关系数为0.4752,表明两者的相关性较好,本次iTRAQ数据可信。生物信息学分析显示1173个DEPs涉及15个细胞组份、11种分子功能和26个生物学过程;有1117个DEPs富集到300个KEGG Pathway通路;免疫相关DEPs的互作网络包含61个节点和227个边缘,Hsp90、转化生长因子β活化激酶1(MAP3K7/TAK1)和主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)等12种蛋白是联系较高的中枢节点,主要富集于吞噬体、抗原加工与递呈、NOD-like受体信号通路等免疫相关通路。4)关键差异表达蛋白的特异性抗体制备。为了制备分别富集于抗原递呈通路与NOD-like受体信号通路中的2个关键性免疫相关DEPs(gcTAK1蛋白和gcMHCⅡ-β蛋白)的特异性抗体,本文利用基因工程技术制备rgcTAK1蛋白和rgc TAK1蛋白,并以此为免疫原免疫新西兰大白兔,制备相应的多克隆抗体。结果获得ELISA效价分别为1::204800与 1:3276800的兔抗rgcTAK1抗体与兔抗MHCⅡ-β抗体40-50 mL。综上所述,本课题通过对疫苗口灌免疫前后草鱼肠组织差异蛋白组学研究,挖掘出140个免疫相关差异表达蛋白,明确其主要富集在抗原递呈、补体与凝血级联、NOD-like受体信号通路等免疫相关通路,并制备了 2个关键免疫相关差异表达蛋白的特异性抗体。研究结果为进一步深入研究双靶向核酸疫苗诱导肠黏膜免疫增强作用的分子调控机制奠定了良好基础。