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目的:在我国,胃癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的第2位,严重威胁着人们的生命健康,且发病率无明显下降趋势。绝大多数胃癌起病隐匿,早期并无明显的临床症状,或出现非特异性症状（如恶心、嗳气、食欲缺乏及上腹不适等）而被忽略,所以胃癌的早期诊断率仍较低,大多数患者在就医时往往已经错过治疗的最佳时期。虽然以胃癌D2根治术为基础的肿瘤规范化治疗正在被广泛推广应用,但我国胃癌患者的5年生存率仍然只有50%左右。Borrmann 4型胃癌被认为是最特殊的一类胃癌,又称弥漫型癌,它与一般胃癌不同,Borrmann 4型胃癌往往生长较为迅速,可以很快便向整个腹腔播散转移,初诊时往往即有腹膜播散。所以Borrmann 4型胃癌手术切除率低,而且实行根治手术后腹膜复发转移多见,预后较其他Borrmann分型胃癌差。因此,深入研究Borrmann4型胃癌的发生发展机制,寻找关键生物标志物和良好的治疗靶点对于预防和治疗Borrmann 4型胃癌有重要意义。鞘氨醇-1-磷酸转运体（Spinster homolog 2,SPNS2）是SPNS/Spinster家族成员之一,是一种膜转运蛋白,其可以利用物质在细胞膜内外浓度不同造成的电化学渗透势能来转运底物。S1P是一种保守的细胞膜磷脂类分解和代谢产物,是由鞘氨醇经鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,SPHK）磷酸化形成,研究发现,S1P广泛参与了机体的免疫调节、血管发育和再生、心脏发育以及神经系统发育等多种生理病理过程,而且S1P还具有调节细胞增殖、迁移、血管及淋巴管形成等多种功能,这些功能均与肿瘤的发生发展密切相关,而SPNS2作为目前发现的惟一具有组织活性的S1P转运体,既往SPNS2与免疫调节、神经系统和心血管系统等多种生理病理过程的研究已经很多,但是SPNS2与肿瘤的发生发展的相关研究还比较匮乏,Bradley等人研究发现SPNS2表达下调是非小细胞肺癌潜在的风险因素。Weyden等人研究发现注射转移性黑色素瘤细胞的SPNS2缺陷小鼠的肺转移的程度大大减小。金荣等人发现SPNS2在结直肠癌中高表达及蛋白的阳性表达与结直肠肿瘤的发生发展有关。而目前,SPNS2在胃癌中的表情况达及其对胃癌的调控作用尚未见报道,基于以上研究现状以及我们对Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1和低分化胃癌细胞系AGS的差异表达基因的分析,本研究目的在于明确差异表达基因SPNS2在Borrmann 4型胃癌中的表达情况,并探索SPNS2对Borrmann 4型胃癌生物学行为的影响以及其潜在的作用机制。研究方法:我们对Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1和低分化胃癌细胞系AGS进行高通量测序,筛选差异表达基因。在差异表达基因中选择数量适当的候选基因,首先利用GEPIA分别分析候选基因在人各器官组织肿瘤与正常组织中的分布情况,分析候选基因在胃癌组织和胃正常组织中表达水平差异。Kaplan-Meier plotter分析候选基因对胃癌患者生存率的影响。利用RT-PCR及Western Blot技术在Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1、低分化胃癌细胞系AGS、中分化胃癌细胞系SGC7901、高分化胃癌细胞系MGC-803以及人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中验证剩余候选基因的mRNA含量及蛋白表达情况。确定好要研究的目的基因后,利用Kaplan Meier-plotter在线分析工具再次详细分析、验证目的基因在胃癌组织中的表达与胃癌患者的预后关系,对不同TNM分期、有无淋巴结转移,有无远处转移进行分层分析。利用免疫组化技术检测290例胃癌组织及158例癌旁正常组织中候选基因的表达情况,免疫组化技术检测Borrmann 4型胃癌组织及其他Borrmann类型胃癌组织中候选基因的表达情况。探究候选基因表达与Borrmann 4型胃癌病例临床病理特点及预后的关系。利用慢病毒转染构建稳定沉默候选基因的OCUM-1细胞系,RT-PCR和Western Blot检测转染效率,选择沉默效率最高组及阴性对照组进行后续实验研究。稳定沉默后,我们通过Transwell小室实验检测稳定沉默细胞株与阴性对照细胞株间侵袭、迁移能力是否有差异,利用CCK-8实验检测细胞间增殖能力是否有差异,同时流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡情况是否有差异。为了进一步探究候选基因对于胃癌生物学行为影响的具体机制。我们首先利用RT-PCR和Western Blot技术检测了沉默组及对照组细胞的EMT相关因子E-cadherin,N-cadherin,Snail,Twist,侵袭相关因子MMP-2,MMP-9的mRNA水平及蛋白表达情况。同时,我们利用RT-PCR和Western Blot技术也检测了沉默组及对照组细胞的PI3K/AKT通路相关因子的mRNA含量及蛋白表达水平。两组资料间比较采取t检验、秩和检验或卡方检验。Kaplan-Meier方法分析患者的生存情况,Log-rank检验比较生存曲线间的差异。Cox比例风险回归模型筛选预后的独立危险因素。所有统计分析采用双边检验,认定P<0.05为具有统计学意义。所有统计分析及图像制作均采用SPSS 22.0以及GraphPad Prism 7.0软件。结果:对Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1和低分化胃癌细胞系AGS进行高通量测序后,检测到OCUM-1共有2544个基因上调,2775个基因下调。我们在2544个上调基因中初步筛选出了4个候选基因,包含SPNS2、ERN2、HMGCS2和EEPD1。在2775个下调基因中初步筛选出了2个候选基因,分别是SULT1C4和C4BPB。首先利用GEPIA分别获取SPNS2、ERN2、HMGCS2、EEPD1、SULT1C4及C4BPB候选基因在人各器官组织肿瘤与正常组织中的分布情况,分析6个候选基因在胃癌组织和胃正常组织中mRNA水平差异。利用Kaplan-Meier plotter分析6个候选基因对胃癌患者生存率的影响。利用网络数据库在线分析工具进行初步筛选后,剔除了HMGCS2和SULT1C4这两个基因。随后,利用RT-PCR技术在Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1、低分化胃癌细胞系AGS、中分化胃癌细胞系SGC7901、高分化胃癌细胞系MGC-803以及人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中验证剩余的4个候选基因的mRNA含量。再次筛选比对后剔除了EEPD1和C4BPB两个候选基因。利用Western Blot技术在同样5中细胞系中检测剩余的2个候选基因的蛋白含量,验证比对后剔除了ERN2候选基因,最终保留SPNS2作为后续研究Borrmann 4型胃癌的目的基因。利用Kaplan Meier-plotter在线分析工具再次详细分析了SPNS2在胃癌组织中的表达与胃癌患者预后的关系,我们发现SPNS2在胃癌中的表达情况与胃癌患者预后有关系,高表达患者预后较差,而且从不同TNM分期、有无淋巴结转移,有无远处转移的分层分析结果来看,基本呈现出TNM分期越晚、淋巴结转移程度越重、有远处转移的SPNS2阳性表达者预后更差,因此我们推测SPNS2在胃癌中的表达情况有可能与胃癌转移情况相关。随后我们利用免疫组化技术检测了290例胃癌组织及158例癌旁正常组织中SPNS2的表达情况。我们发现SPNS2在癌旁正常组织中几乎不表达,而在胃癌组织中阳性表达率较高,而Borrmann 4型胃癌组织中的SPNS2阳性表达率更是明显高于其它Borrmann类型胃癌组织。通过分析SPNS2表达与Borrmann 4型胃癌病例临床病理特点的关系发现,SPNS2阳性表达的Borrmann4型胃癌病例浸润深度更深,淋巴结转移程度更重,TNM分期更晚,SPNS2阳性表达的病例中N3a及N3b期及TNM III期病例比例更高。通过分析SPNS2表达与Borrmann 4型胃癌预后的关系,我们发现在Borrmann 4型胃癌病例中,SPNS2阳性表达的病例长期生存明显差于SPNS2阴性表达的病例。单因素分析及多因素分析结果均提示SPNS2阳性表达是Borrmann 4型胃癌的独立不良预后因素,SPNS2阳性表达患者的死亡风险是SPNS2阴性表达患者的4.129倍。敲减SPNS2的内源性表达后,OCUM-1细胞的迁移能力及侵袭能力明显减弱,提示SPNS2基因的表达对Borrmann 4型胃癌细胞的迁移及侵袭可能有促进作用。CCK-8实验显示敲减SPNS2的内源性表达后,其增殖能力低于阴性对照组,这提示SPNS2基因的表达对Borrmann 4型胃癌细胞的增殖能力可能有促进作用。进一步通过流式细胞仪检测细胞周期发现敲减SPNS2的内源性表达后,其G0/1期比例下降,G2/M期比例上升,这说明细胞周期可能阻滞于G2/M期,导致了细胞增殖能力的减慢。但敲减SPNS2的内源性表达后细胞凋亡情况未发生明显变化。通过上述实验,提示SPNS2基因的表达可能促进了Borrmann 4型胃癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力,并对细胞周期产生影响。为进一步探究SPNS2调控Borrmann 4型胃癌迁移及侵袭能力的分子机制,我们利用RT-PCR和Western Blot技术检测了KD组及NC组细胞的EMT相关因子E-cadherin,N-cadherin,Snail,Twist,侵袭相关因子MMP-2,MMP-9的mRNA水平及蛋白表达水平。我们发现,敲减内源性SPNS2后,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin,Snail,twist及MMP-9的表达水平下降。同时,我们利用RT-PCR和Western Blot技术也检测了KD组及NC组细胞的PI3K/AKT通路相关因子的mRNA含量及蛋白表达水平。我们发现,敲减内源性SPNS2表达后,PIK3CA和AKT1蛋白表达水平下降,因此我们推测SPNS2可能通过PI3K/AKT通路影响EMT及侵袭相关因子的表达,进而影响Borrmann 4型胃癌的侵袭转移能力。结论:1、Kaplan Meier-plotter分析结果提示在胃癌中SPNS2高表达者预后更差。2、免疫组化分析结果提示与癌旁正常胃粘膜组织相比较,SPNS2在胃癌组织中表达明显升高,在Borrmann 4型胃癌组织中阳性表达率比其他Borrmann分型胃癌组织更高。3、在Borrmann 4型胃癌组织中,SPNS2阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移程度以及TNM分期明显相关,且高表达患者的生存期更短,SPNS2阳性表达是Borrmann 4型胃癌的独立不良预后因素。4、SPNS2沉默后可显著抑制Borrmann 4型胃癌细胞系OCUM-1的侵袭、迁移及增殖能力,并可影响细胞周期的变化,但不影响细胞的凋亡。5、SPNS2可能是通过PI3K/AKT通路影响OCUM-1的EMT相关因子及侵袭相关因子的表达,进而调控OCUM-1的迁移能力和侵袭能力。