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研究背景与目的:SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白,在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用,并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白,如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如pRB)、肿瘤抑制因子p53等,诱导多种细胞的永生化。通过对SV40大T抗原介导的永生化细胞系的深入研究发现,SV40大T抗原基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后,不但能在细胞内表达SV40大T抗原,加快转化细胞的生长速率,同时也能保留原始细胞的许多分化表型,具有相对稳定的增殖特性和功能状态,而非原始基因的表达很少见。因此,通过建立SV40大T抗原所介导的永生化细胞系,不仅有助于我们了解细胞的增殖与衰老的分子机制,为我们攻克肿瘤和延缓衰老提供理论依据。同时可多次传代的永生化细胞,以其具有的相对稳定的增殖特性和功能状态,可以作为标准细胞应用在细胞工程和组织工程等研究领域的。本课题拟构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,转染包装细胞系293FT获得重组慢病毒,通过感染真核细胞,观察所构建的慢病毒表达载体在宿主细胞内的整合情况及所携带的SV40大T抗原的表达对宿主细胞传代的作用,为研究和建立SV40大T抗原介导下的永生化细胞系奠定基础。方法:以含有SV40大T抗原基因的质粒为模板,通过PCR克隆出SV40大T抗原基因作为靶基因;将靶基因连接到pGEM-T Easy载体上,以pGEM-T-Tag克隆质粒转化感受态E.coli JM109,利用Amp抗性和蓝白筛选试验筛选出含有所需的pGEM-T-Tag质粒的白色菌落,以T7/SP6为引物扩增靶基因来确认所需的阳性克隆,并进行DNA测序以确认克隆的靶基因的准确性;将重组质粒pGEM-T-Tag和慢病毒载体pLentiGFP同时用BamHⅠ酶切,电泳胶回收纯化后对线性载体pLentiGFP进行羟化处理,再将线性载体pLentiGFP与靶基因SV40大T抗原基因连接,以重组载体pLentiGFP-Tag转化感受态E.coli DH5α,将培养出的菌落以亚克隆鉴定引物L1/T2为引物鉴定出阳性克隆(正插重组子)。将筛选出的阳性克隆表达载体pLentiGFP-Tag与慢病毒辅助包装载体共转染293FT细胞,培养产生出慢病毒颗粒。以慢病毒颗粒感染家兔骨髓基质细胞,通过观察重组慢病毒所携带的EGFP基因在细胞内的表达及进行RT-PCR的检测确认重组慢病毒与宿主细胞的整合和SV40大T抗原基因在细胞内的表达。其后进行感染细胞的连续传代培养,观察SV40大T抗原对细胞传代生长的作用。结果:1.靶基因的扩增及电泳分析:以含有SV40大T抗原基因的质粒为模板,目的基因扩增引物T1/T2为引物通过PCR技术扩增得到与SV40大T抗原基因片段大小相符的约2154bp的基因片段,电泳分析证实。2.靶基因的克隆及鉴定:靶基因与pGEM-T Easy载体连接后,组成重组质粒pGEM-T-Tag,经由转化感受态E.coli JM109,蓝白筛选试验后随机选取其中的4个阳性菌落,以克隆鉴定引物T7/SP6为引物进行PCR扩增,均得到大小约为2330bp的基因片段,为阳性克隆,再由DNA测序后确认与SV40大T抗原基因序列一致。3.靶基因的亚克隆及重组子的鉴定:将羟化后的pLentiGFP双粘质粒与双粘靶片段SV40大T抗原基因相连接,组成重组子pLentiGFP-Tag,转化感受态E.coli DH5α后,对4个阳性克隆以亚克隆鉴定引物L1/T2为引物进行PCR扩增,其中有3个克隆的扩增产物大小约为2274bp,为阳性克隆(正插重组子)。4.重组慢病毒的包装纯化及滴定:将筛选出的阳性克隆表达载体pLentiGFP-Tag与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞48～72小时后,离心获得pLentiGFP-Tag包装的慢病毒,病毒滴度为2.4×10~6IU/ml。5.重组慢病毒的感染及靶基因的表达:在表达Tag的慢病毒感染家兔骨髓基质细胞48小时后观测到绿色荧光蛋白在细胞内的广泛表达,空白对照组未发现绿色荧光蛋白的表达。进一步通过RT-PCR检测到表达Tag的慢病毒感染组细胞内有SV40大T抗原mRNA的高水平表达,对照组均为阴性。6.SV40大T抗原对细胞生长的作用:表达Tag的慢病毒感染组细胞培养至第10代,依然生长良好。对照组细胞5代后全部死亡。表明pLentiGFP-Tag包装的慢病毒感染兔BMSCs细胞后,可以显著提高原代培养兔BMSCs细胞的传代次数。结论:本试验利用分子生物学方法,成功构建了携带有SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,并在包装成为慢病毒后成功的实现了对真核细胞感染,观察到SV40大T抗原在细胞内的表达。进一步观察到pLentiGFP-Tag能够有效延长真核细胞传代的次数。通过此项研究,可以为进一步研究和建立SV40大T抗原介导下的永生化细胞奠定基础。