DNA探针在纳米孔分析检测中的应用

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纳米孔技术是一种新颖的单分子检测技术,近年来在DNA测序、单分子化学及蛋白质分析方面得到了广泛应用。DNA分析传感技术,是以核酸为分子识别原件,将待检测物的存在转变为光,声,电等信号来进行检测。由于DNA分子探针特异性强,生物相容性好,其在基因诊断,药物研究,环境监测,生物大分子检测中显示了广泛的应用前景。本论文将纳米孔技术与DNA分析传感技术结合,以解决复杂体系中的干扰性问题和多组分同时检测为科学目标,通过构建新颖的DNA编码,建立了两种适用于复杂体系并可实现同时检测的新方法。  论文中在单链DNA分子上引入主客体复合物二茂铁(∈)瓜环[7](Fc(∈)CB[7]),构建了一种新型DNA探针。应用DNA-Fc(∈)CB[7],并结合适配体DNA技术,建立了对目标分子的普适性检测方法。在这一探针的基础上,通过改变化学修饰位点、修饰官能团及DNA长度,构建了五种编码DNA。结合免疫分析技术,建立了对癌症标志物检测的新方法,并可在同一样品中实现多组分同时检测。本论文的具体内容如下。  一,结合DNA适配体技术,构建对目标分子普适性检测的方法。首先,将客体分子二茂铁通过click反应共价连接在DNA上,然后再与主体分子瓜环[7]共孵育,通过主客体包和作用最终得到DNA-Fc(∈)CB[7]三元结构的探针。在高浓度电解质溶液中,探针与溶血素蛋白纳米孔相互作用能够产生特征的多级电流信号。结合适配体技术,目标分子竞争结合适配体,导致互补序列的探针释放到溶液中。探针在随后的纳米孔检测平台输出的特征信号与目标分子相互对应,从而为目标分子定量分析提供依据。实验分别对血管内皮生长因子VEGF、凝血酶、小分子可卡因进行了检测,检测限分别为0.5nM、5nM、5μM。与磁珠分离技术结合后,VEGF检测限可达到5pM。  二,构建编码DNA,建立纳米孔中多组分同时检测的方法。通过改变DNA分子中化学修饰位点、官能团及DNA长度,构建了五种编码DNA,分别为DNA1-Fc(∈)CB[7]、DNA2-Fc(∈)CB[7]、DNA3-Fc(∈)CB[7]、DNA4-Fc(∈)CB[7]、DNA5-Ad(∈)CB[7]。编码DNA穿越纳米孔时,能够产生区分度高、特异性强的特征电流信号。结合免疫分析技术,癌症标志物加入后,与磁珠、纳米金形成夹心结构,然后释放纳米金表面编码DNA,实现癌症标志物单独及同时检测。五种癌症标志物检测限分别为PSA:8fM、AFP:20fM、CEA:100fM、NSE:50fM、CA19-9:1mU/mL。  利用目前丰富的适配体DNA序列库与抗原抗体数据库,本论文所发展的策略可推广到其它大分子蛋白、有机小分子、酶和癌细胞的检测,具有广泛的应用前景。
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