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据ACancer Journal for Clinicians报道,2018年全球范围内将会有1810万癌症新发病率和960万癌症死亡病例,相比于其他国家,我国癌症发病率、死亡率均为全球第一。在1810万新增癌症病例中,我国占380.4万例;在960万癌症死亡病例中,我国占229.6万例。国际上许多化疗药物既杀伤肿瘤细胞,也损伤正常细胞,而多糖是一种能够杀伤肿瘤细胞且增加机体免疫功能的生物活性物质,因此多糖就成为国内外研究的热点之一。高粱乌米(Sporisorium reilianum)是一种植物病原真菌,高粱乌米具有多种生物学活性,高粱乌米活性成分(多糖)也被证明具有抗肿瘤、抗氧化等作用。本文从高粱乌米子实体中分离纯化得到中性多糖级分(WM-N)和酸性多糖级分(WM-A),而酸性多糖级分得率与糖含量极低且难于纯化,故本文主要针对均一级分中性多糖的结构和生物活性展开研究,包括以下几方面:(1)本文利用热水浸提乙醇沉淀方法从高粱乌米子实体中提取高粱乌米粗多糖(WM),经DEAE-纤维素离子交换柱层析分级、膜分离和醇沉纯化等分离纯化后获得均一级分的多糖,命名为WM-NP-60。采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定分子量,使用高效液相色谱法(HPLC)法分析单糖组成,多糖WM-NP-60分子量为15.6 kDa,且由Glc(93.3%)和Gal(6.7%)组成;紫外光谱显示多糖级分中不含蛋白质和核酸。多糖WM-NP-60的旋光度为右旋0.049。红外光谱(FT-IR)分析表明其具有吡喃糖结构。通过高碘酸氧化、Smith降解、核磁共振谱(1D/2D NMR)和甲基化法对多糖WM-NP-60的表征分析,我们可以推测出多糖WM-NP-60的结构是以β-1,6-D-Glcp作为主链,约3%主链上的糖基在3位形成分支连接侧链,侧链以线性β-1,3-D-Glcp为主,Gal可能多以末端形式作为侧链连接在主链上,或者连接在线性β-1,3-D-Glcp侧链上。(2)多糖WM-NP-60抗氧化作用研究结果显示,多糖WM-NP-60都具有显著地清除DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基、羟基自由基(·OH)、超氧负离子(O2-·)和过氧化氢(H2O2)的能力,螯合二价铁离子Fe2+和抑制邻苯三酚自氧化的能力,以及出色的还原力,表明其具有良好的抗氧化活性。(3)MTT实验证明多糖WM-NP-60对HepG2、SGC7901和HCT116细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖效应,且对HCT116细胞抑制作用最为显著;多糖WM-NP-60能够阻滞HepG2、SGC7901和HCT116细胞周期于G1期,从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡;荧光显微镜方便而直接地检测到磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)的外翻这一细胞凋亡的重要特征;透射电镜观察HepG2、SGC7901和HCT116细胞凋亡形态特征,可见典型的凋亡小体。(4)利用 TMT(Tandem Mass Tags)和 2D-LC-MSMS 技术鉴定分析了多糖 WM-NP-60处理对HCT116细胞中蛋白表达的影响,369个蛋白被鉴定为差异表达蛋白(Differentially Expressed Proteins,DEPs),其中下调有 129 个,上调有 240 个;并进行了相应的生物信息学分析,发现 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集到15项差异显著的代谢通路(P<0.05),其中Focal adhesion信号通路和TGF-β信号通路跟细胞周期和细胞凋亡相关;PPI(Protein-Protein Interaction)分析表明6个差异表达蛋白都处在关键节点上,qRT-PCR和Western blot验证实验发现在TGF-β信号通路上,多糖WM-NP-60上调了TGFβR1、p107和DP1基因表达,并下调了THBS1基因表达,从而阻滞细胞周期于G1期,抑制了 HCT116细胞增殖并诱导其凋亡;在Focal adhesion信号通路上,多糖WM-NP-60能上调ITGA7和Rap1基因,从而阻滞细胞周期于G1期。本研究首先利用热水浸提乙醇沉淀方法,从高粱乌米子实体中提取纯化得到均一多糖WM-NP-60;然后对多糖WM-NP-60的结构特征进行分析,推测出多糖WM-NP-60的结构;并研究证明多糖WMNP-60的抗氧化作用和对HepG2、SGC7901和HCT116细胞的抑制并诱导其凋亡;最后采用TMT和2D-LC-MSMS技术分析鉴定差异表达蛋白,结合细胞周期、细胞凋亡、生物信息学和相关蛋白验证实验推测多糖WM-NP-60抗肿瘤的分子机制。