【研究背景与目的】丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球重要的公共卫生问题,影响着全世界约3%的人口,每年导致超过35万的死亡病例。HCV感染慢性化程度非常高,病程进展隐匿,终末期患者常伴有慢性肝疾病的发生,包括肝脂肪变性、肝纤维化,甚至发展为肝细胞肝癌。目前,并无有效的预防性或治疗性疫苗问世。早期治疗HCV感染一般采用聚乙二醇干扰素加利巴韦林,疗效在不同基因型中差别较大、治疗时限较长、不良反应较多。近几年,针对HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向性药物,又称直接作用的抗病毒药物(DAA)得到了飞速的发展,有效提高了治疗患者的持续病毒应答率(SVR)。然而,DAA的使用仍旧受到一些问题的限制,如耐药突变的产生、药物附带的一些不良反应、不可忽视的高昂治疗费用等。因此,对HCV感染过程的进一步研究,包括研制针对病毒生命周期不同阶段的新型药物,及解析病毒与宿主相互作用中的关键分子等,都将加深我们对HCV感染机制的认识,也为发展更高效、耐受性更好的抗HCV药物提供研究基础与助力。HCV的感染包括病毒颗粒的入侵、病毒基因组的翻译与复制、成熟病毒颗粒的组装与释放这些步骤。目前上市的DAA药物主要通过抑制病毒非结构蛋白的成熟或酶的活性进而阻断病毒复制的过程。然而,这些药物由于靶向高度变异的病毒成分,其基因屏障相对较低,且难以起到预防感染的作用,这也是HCV终末期患者肝移植后的病毒再感染率居高不下的一个原因。HCV入侵是一个高度协调的多步骤过程,包括病毒的非特异性结合、与靶细胞入侵相关受体的相互作用、病毒内吞入靶细胞及与宿主细胞间的膜融合。这个过程为抗HCV治疗提供了许多新的靶点,这些靶点由于多靶向宿主细胞成分,因此具有较高的基因屏障。由于入侵抑制剂干扰的是病毒生命周期最开始的阶段,此时病毒基因组并未释放,因此具有同时预防与治疗病毒感染的作用。入侵抑制剂与目前的抗HCV药物联合运用,即病毒生命周期多个阶段的靶向联合治疗,可能成为未来抗HCV治疗的一个主要方向。研发新型的覆盖多基因型的高效HCV入侵抑制剂十分必要。HCV的感染会引起宿主细胞内环境的改变,多种宿主因子的表达会发生变化。在这其中,一些分子表达水平的变化会进一步影响病毒的感染过程。增进对这类分子,尤其是具有抑制病毒感染作用分子的认识和研究,将大大促进抗HCV研究的发展。非编码RNA(nc RNA)早前被认为在细胞中并无实际功能。近几年,随着生物技术的发展及研究的深入,越来越多的非编码RNA被发现在各种的生理或病理过程中发挥着重要作用。其中对长度小于200 bp的微小RNA(mi RNA)的研究较多,它的作用方式和机制目前已经解析得较为透彻。在HCV感染中,较为熟悉的有mi R-122,它通过与病毒基因组5’UTR区域的相互作用促进病毒的复制,其抑制剂目前已进入临床试验阶段。我室之前也有报道mi R-221通过靶向干扰素通路抑制性分子来增加IFN的抗HCV的活性。然而关于长度大于200 bp长链非编码RNA(lnc RNA)的研究仍处于初步阶段,其在病毒感染中的研究更少之又少,在HCV感染中的作用更无报道。因此,研究lnc RNA在HCV感染中的作用将进一步完善病毒与宿主相互作用过程的阐述,也为抗病毒药物提供新的作用靶点。目前抗HCV治疗药物多为针对某一靶点人工合成的化合物,造价昂贵,并可能在人体中产生一定的不良反应。细胞疗法是近期较为流行的治疗方法之一,其中又以间充质干细胞(MSC)疗法最为常见,它可通过旁分泌一定的生物学活性物质发挥作用。外泌体就是实现其旁分泌功能的主要介质。研究显示,外泌体既可在细胞间传递传染性病原体也可以传输保护性物质抑制病原体感染。已有报道称HCV感染细胞分泌的外泌体可以传递具有感染性的病毒颗粒至其他细胞。然而,并无携带具有抗HCV物质外泌体的报道。人干细胞来源的外泌体是生理培养下的人干细胞成分,生产成本较低,不良反应也较少,是未来再生医学的重要组成部分。因此,研究其在HCV感染过程中的作用具有现实意义。第一部分抗HCV活性天然化合物的筛选及机制研究方法:通过HCV体外感染模型,从数百种天然药用植物来源的化合物中,高通量筛选出具有抗HCV活性的来源于保肝中药五味子的四环三萜类化合物甘五酸(SZA)和来源于抗炎中药络石藤的木脂内酯类化合物络石藤苷元(TGN)。应用不同基因型的单周期HCV假病毒颗粒及原代人肝细胞,初步分析化合物对病毒入侵的影响。继而通过病毒动力学实验,精确定位化合物抗HCV的有效靶点。采用密度梯度超速离心法分析化合物对病毒本身脂密度及感染性的影响。利用流式细胞术、免疫印迹及病毒结合活性实验排除化合物对HCV靶细胞表面入侵相关受体的作用。以Di D介导的膜融合动态监测实验研究SZA对入侵结合后的膜融合环节的作用,利用荧光染料Prodan检测了SZA对脂质膜流动性的影响;通过流式细胞术检测TGN对结合到细胞表面的病毒E2含量的影响,设计CD81与HCV E2的免疫共沉淀实验并检测TGN在其中的作用,利用预测软件对TGN在CD81上的作用位点进行预测分析。测试SZA和TGN在细胞间病毒传递及与临床上抗HCV药物联合运用的效果。综合分析SZA和TGN的抗HCV疗效、作用靶点及靶向病毒生命周期的抗病毒机制。结果:SZA和TGN细胞毒性较小,可显著抑制细胞来源的HCV(HCVcc)和HCV假病毒颗粒(HCVpp)感染靶细胞。SZA和TGN在不同型别的HCVpp中的抑制效果一致,并能阻断HCVpp入侵原代人肝细胞。动力学实验提示,两者的作用靶点位于病毒感染早期入侵阶段的结合后步骤。SZA和TGN对病毒本身的脂密度和RNA水平的分布,及细胞表面入侵受体表达量和病毒结合活性并无显著影响。DID介导的膜融合动态监测实验提示,SZA可能通过破坏病毒与细胞膜融合的过程抑制病毒感染。同时,细胞脂质膜的流动性也在SZA的作用下升高。TGN则干扰了HCV E2蛋白与入侵关键分子CD81之间的相互作用,且分子预测软件结果显示,CD81大胞外环上的Thr166、Asn184、Lys187或Glu188与TGN形成的氢键可能在TGN抑制病毒入侵中发挥着重要作用。此外,SZA和TGN能显著抑制细胞间病毒的传递,且与干扰素或VX-950联合运用后具有协同抑制病毒感染的效果。结论:天然植物来源的SZA和TGN具有显著的抗HCV感染的活性。两者的作用机制为干扰了HCV感染早期的必要步骤即病毒入侵,与目前传统的DAA的治疗靶点不同,可作为HCV感染预防及对现有疗法的补充,具有广阔的应用前景。第二部分抗HCV长链非编码RNA的高通量筛选及机制研究方法:通过高通量测序发现在HCV感染前后差异表达的系列Lnc RNA。其中,Lnc RNA GAS5所有转录体在HCV感染后都呈高表达。通过进一步过表达或下调该Lnc RNA,发现GAS5的上调可以显著抑制HCV的感染,下调则促进感染。随后,应用单周期HCV假病毒颗粒,排除GAS5对病毒入侵的影响。通过转染病毒RNA入靶细胞或利用HCV复制子细胞实验,检测GAS5对HCV复制的影响。构建GAS5的不同截短体,通过观察它们在病毒感染中的作用,明确GAS5的功能序列。使用预测软件分析可能与GAS5相互作用的蛋白,并从中挑选出与HCV感染尤其是复制相关的蛋白,利用RNA免疫共沉淀(RIP)技术明确两者之间的相互作用。构建缺失GAS5功能序列的截短体,进一步明确这段序列的抑制作用。综合评估GAS5抑制HCV感染的靶点和所涉及到的相关机制。结果:GAS5在HCV感染细胞的胞质中高表达,并随感染剂量的上升及感染进展而升高。在Huh7细胞中过表达GAS5,可显著抑制HCVcc感染靶细胞;下调GAS5的水平则促进病毒的感染。GAS5对不同基因型HCV假病毒颗粒(HCVpp)入侵靶细胞并无明显抑制效果。在HCV复制子细胞中过表达GAS5后能显著降低胞内病毒RNA水平,干扰GAS5能提高病毒RNA的表达。GAS5的不同截短体,包括GAS5-251都能抑制病毒的感染。软件预测GAS5前200 bp与HCV NS3可能存在相互作用。利用RIP技术,将与GAS5相互作用的蛋白拉下,通过Western-blot检测发现,过表达GAS5可显著拉下HCV NS3蛋白,提供了GAS5与病毒NS3蛋白相互作用的依据。缺失GAS5前200序列的截短体失去原有的抗HCV活性,进一步证实了GAS5前200个序列为与病毒蛋白相互作用起抑制效果的功能序列。结论:Lnc RNA GAS5具有显著的抗HCV的效果,其作用机制为通过与HCV NS3蛋白的相互作用,干扰NS3蛋白酶的活性,进而阻碍病毒的复制。GAS5在感染中高表达可能涉及宿主对病毒感染的抵御作用,为阐明抗病毒机制、发展抗病毒药物等提供助力。第三部分间充质干细胞来源的外泌体抗HCV感染的作用及机制研究方法:利用脐带间充质干细胞(u MSC)的上清及Transwell共培养检测u MSC旁分泌在HCV感染中的作用。进一步分离获得上清中的外泌体(u MSC-Exo),明确外泌体在病毒感染中的效果。利用动力学实验明确u MSC-Exo在病毒感染生命周期中抑制的阶段。通过单周期HCV假病毒颗粒,排除u MSC-Exo对病毒入侵的影响。应用电穿技术将病毒RNA转染入靶细胞或HCV复制子细胞,评估u MSC-Exo对HCV复制的影响。检测转染病毒RNA的细胞内外病毒颗粒的再感染性,明确u MSC-Exo对病毒组装、释放的影响。通过蛋白酶K实验确定外泌体中何种成分具有抑制HCV感染的活性。对u MSC-Exo中的小RNA进行测序,选取在其中高表达的前15个micro RNA(mi RNA),并利用功能性实验包括过表达或干扰技术,明确具有抑制HCV感染功能的mi RNA。将鉴定的mi RNA的抑制剂转染u MSC,检测其分泌的u MSC-Exo的抗病毒活性。将u MSC-Exo与临床上的抗HCV药物联合运用,并评估其抑制效果。结果:u MSC可通过旁分泌抑制靶细胞中HCV的感染,且u MSC-Exo是这个过程中主要起效的活性物质。u MSC-Exo能有效进入Huh7细胞中,降低感染细胞的病毒RNA水平和病毒蛋白的表达。u MSC-Exo对HCV的入侵并无影响,但是能显著抑制病毒的复制。蛋白酶K实验明确u MSC-Exo起效的分子为其内的RNA成分。u MSC-Exo的小RNA测序中高表达的前15个mi RNA中,有9个mi RNA在u MSC-Exo处理的靶细胞中高表达,而功能性实验提示其中4个mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)在u MSC-Exo的抗病毒效果中发挥主要作用。将这4个mi RNA的抑制剂转染u MSC后,其分泌的u MSC-Exo的抗病毒效果明显下降。将u MSC-Exo与IFN或VX-950联合运用能协同抑制HCV的感染。结论:u MSC-Exo具有显著的抗HCV的活性,其作用机制为通过外泌体包裹的具有抗HCV感染作用的mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)抑制病毒的复制,进而阻断病毒感染。此工作为解析HCV感染的分子机制及抗病毒治疗的发展提供了新的思路和可能性。【小结】本研究通过高通量筛选天然化合物库,发现了具有抗HCV活性的SZA和TGN,进一步研究发现两者分别通过靶向病毒膜融合及入侵关键受体CD81抑制HCV的入侵。通过高通量测序发现在HCV感染后上调的lnc RNA GAS5,分析其作用机制为通过与病毒NS3蛋白相互作用,干扰其活性,从而阻碍病毒的复制。首次发现u MSC-Exo具有抑制HCV感染的作用,它起效的方式是传递u MSC-Exo包裹的特有的具有抗HCV活性的mi RNA至感染的靶细胞。以上这些研究成果发现并鉴定了外源性及内源性HCV抑制性分子,为阐明HCV感染的分子机制及抗病毒治疗的发展提供了助力。