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研究目的:有氧运动能够增加机体能量代谢水平,并且作为一种既经济又实用的治疗干预手段越来越引起人们的重视,已应用于临床胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)和代谢性疾病的预防和治疗。但是,目前对于有氧运动调控骨骼肌能量代谢在改善IR中作用机制认识上的不足严重妨碍了运动疗法在临床的广泛应用。哺乳动物细胞一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-actived Protein Kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,m TOR)信号通路是机体组织细胞能量和营养素调节的重要途径,在机体肥胖和IR等代谢性疾病的发生发展过程中发挥重要调节作用。大量研究证实,AMPK/m TOR信号通路还是一条运动敏感型通路。因而本研究试图揭示AMPK/m TOR信号通路活性在有氧耐力运动改善小鼠胰岛素抵抗中的作用和分子生物学机制。m TOR可以通过调节脂肪酸的合成代谢过程对细胞的代谢稳态产生影响。与此同时,研究发现细胞可以通过AMPK/m TOR信号通路对生长因子、营养素水平、应激以及胞内能量状态等信息进行整合,参与细胞自噬(Autophagy)活性的调节。另外,Sestrins是近年发现的高度保守的细胞应激诱导蛋白,可在氧化应激状态下通过清除细胞内氧化自由基(Reactive oxygen species,ROS)的堆积而发挥细胞保护作用,并且与细胞AMPK/m TOR信号通路活性有着密切联系。因而本研究从AMPK/m TOR参与的脂代谢和自噬调节两方面探讨其在有氧运动改善IR中的作用和分子生物学机制。研究方法:本研究于在体、离体两方面同时开展研究,探讨AMPK/m TOR信号通路在骨骼肌细胞脂肪酸代谢和自噬活性调控中的作用及其在有氧运动改善IR中的相关作用机制。1.动物模型的建立5周龄C57BL/6小鼠随机分为正常饮食组(NC)和高脂饮食组高脂饮食组喂养高脂饮食10周后建立IR模型。随后将高脂饮食组再次随机分为高脂饮食安静组(HC)和高脂饮食运动组(HE)。2.代谢表型的检测本课题采用ELISA法检测空腹血清胰岛素值;酶法检测小鼠血清总胆固醇(TC)以及甘油三酯(TG)水平;口服葡萄糖耐量(OGTT)检测小鼠葡萄糖耐量。3.基因芯片分析骨骼肌基因表达谱分离各组小鼠股四头肌后,提取总RNA,经荧光标记后进行芯片杂交,利用芯片扫描仪记录荧光信号,并采用相关软件对所得数据进行统计学分析。4.细胞培养及干预方案小鼠肌原细胞系C2C12经2%马血清培养诱导分化为肌管细胞。使用游离脂肪酸棕榈酸酯(Palmitate)刺激细胞;采用si RNA抑制S6K1表达;使用Rapamycin抑制细胞m TORC1活性;转染GFP-LC3表达质粒,观察细胞自噬水平;使用3-MA抑制细胞自噬活性。5.生化指标检测采用Real-time PCR检测基因表达;采用Western Blot方法检测蛋白表达;使用2-脱氧葡萄糖荧光类似物(2-NBDG)检测骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力;使用免疫共沉淀IP检测蛋白间的相互结合。研究结果:1.长期高脂饮食及运动对C57BL/6小鼠代谢的影响HC组小鼠体重、血清空腹胰岛素、血清甘油三酯、以及总胆固醇水平显著高于NC组小鼠;而HE组小鼠6周的有氧运动干预则显著逆转了这一趋势。OGTT结果表明,长期高脂饮食引起HC组小鼠葡萄糖耐量显著降低,而6周有氧运动干预后HE组小鼠则相对HC组有显著改善。采用基因芯片研究长期高脂饮食和有氧运动对小鼠骨骼肌基因表达谱的影响。通过对数据进行分析,发现大量差异表达基因,并且代谢相关基因占较大比重;初步筛选出40个差异表达基因可能参与了长期有氧运动改善IR的过程;通过采用Real-Time PCR方法对芯片结果进行了验证,所选基因RT-PCR鉴定的表达趋势与基因芯片结果相一致。2.AMPK/m TOR的脂代谢调节在运动改善骨骼肌胰岛素敏感性中的作用单游离脂肪酸Palmitate引起C2C12细胞m TOR/S6K1信号途径、AKT活性显著提高,而IRS1活性则显著降低;通过向C2C12转染si RNA抑制S6K1表达后,IRS1/AKT信号活性显著升高,在骨骼肌细胞内证实了m TOR/S6K1对IRS1/AKT信号负反馈调节机制的存在;而在Palmitate干预条件下,对S6K1表达抑制,虽然IRS1活性有所提高,但对AKT的活性水平没有显著影响,表明m TOR/S6K1以及IRS1并非是介导游离脂肪酸诱导的AKT激活过程中重要的介质分子。Palmitate干预引起C2C12细胞AMPK活性显著降低;Palmitate干预C2C12细胞,在AMPK激动剂AICAR引起AMPK的激活后m TOR/S6K1以及AKT活性均显著降低;而在给予AMPK抑制剂Compound C干预后,S6K1以及AKT S473位点磷酸化水平显著提高,表明AMPK能抑制m TOR/S6K1以及AKT的活性。另外,S6K1的表达抑制对Compound C引起的AKT活性提高没有显著影响,表明m TOR/S6K1并非是介导AMPK对Akt信号活性抑制作用的的主要途径。长时间单游离脂肪酸浸润引起C2C12细胞SREBP-1c剪切增加,而AICAR引起的AMPK的激活则显著降低了SREBP-1c剪切与激活;另一方面,采用si RNA抑制S6K1表达后,C2C12细胞SREBP-1c表达水平显著降低。在给予C2C12细胞Compound C干预后,AMPK活性的抑制引起SREBP-1c表达水平显著升高,而这一效应可以被靶向S6K1的si RNA引起的S6K1表达抑制所阻断,表明m TOR/S6K1信号通路介导了AMPK对SREBP-1的抑制作用。在体研究中,长期高脂饮食引起SREBP-1的剪切增加,而6周有氧运动则显著逆转了这一趋势。AICAR引起AMPK的激活引起Palmitate培养的C2C12细胞CPT-1表达的显著增加,而采用si RNA对S6K1表达的抑制对CPT-1蛋白表达没有显著影响;S6K1表达抑制引起转录调控因子SREBP-1靶基因ACC总蛋白表达水平显著降低。3.AMPK/m TOR的自噬调节在运动改善骨骼肌胰岛素敏感性中的作用单游离脂肪酸Palmitate刺激引起C2C12细胞自噬水平的迅速升高,并且糖摄取能力也显著提高;而在给予细胞自噬抑制剂3-MA干预后,细胞对葡萄糖摄取能力显著降低。采用Compound C引起C2C12细胞AMPK活性的抑制可以引起自噬活性的显著降低;而另一方面,在给予细胞3-MA干预后,细胞AMPK活性也显著降低。在给予小鼠1小时的有氧运动干预后,C57BL/6小鼠骨骼肌自噬水平及AMPK活性水平均显著提高。而AMPKα2-/-小鼠骨骼肌细胞自噬水平显著低于野生型对照小鼠,表明骨骼肌组织AMPKα2在单次急性运动引起的细胞自噬激活过程中发挥着重要作用。长期有氧运动可引起骨骼肌细胞应激诱导蛋白SESN2以及SESN3表达水平显著提高;而单次急性运动引起AMPKα2与SESN2和SESN3之间结合显著增加。研究结论:1.6周有氧运动可以显著改善C57BL/6小鼠由长期高脂饮食诱导的IR;2.骨骼肌细胞AMPK信号通路通过调节m TOR/S6K1信号通路的活性而抑制转录因子SREBP-1c的剪切与激活,并通过调节其下游效应蛋白的表达,从而影响细胞脂肪酸的合成过程;3.运动引起的AMPK与Sestrins的结合可能在AMPK介导的骨骼肌自噬激活以及代谢适应方面发挥着重要作用。