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乳酸菌作为益生菌成员,其活菌以及代谢产物不仅具有抑菌功能,还能够增强机体免疫,且不易产生耐药性,对人畜无毒副作用。乳酸菌被确认为是健康阴道微生物菌群中的优势物种,缺乏乳酸菌被认为会破坏阴道微生物菌群平衡,降低免疫屏障功能,继而引发各种生殖道炎症,寄生虫病以及真菌、衣原体的感染等。本研究从健康奶牛阴道内分离、纯化并筛选出无芽孢无荚膜且形体正常、菌体染色呈革兰氏阳性,菌落形态、菌体特征以及生长特性具有传代稳定性的、同时具有益生特性的优势乳酸菌。在此基础上,对其抗菌作用、抗菌成分进行了研究,探讨了SQ0048对TLRs介导的MyD88/NF-KB信号通路的影响。以期为制备治疗奶牛阴道炎症的微生态制剂提供试验依据和奠定理论基础。具体研究内容如下:1.为了获得能够防治奶牛生殖道炎的益生乳酸菌菌株,采用微生物学方法,对50例健康奶牛阴道菌群进行了初步分离;分别采用发酵工程学技术、显微镜检查法、革兰氏染色法及酸度测定方法,测定了初步分离乳酸菌的传代稳定性、染色特性、分类及产酸性能;分别采用显微镜检查法、生化鉴定法和分子生物学方法,对初步筛选出的8株益生乳酸菌进行了形态学鉴定、生理生化特性及16srDNA鉴定;分别采用酸度测定法、过氧化氢酶试验和牛津杯法,进一步测定了经16srDNA鉴定出的菌株的产酸性能、产过氧化氢性能以及抗菌活性。结果显示:从健康奶牛阴道样品中共分离出55株乳酸菌菌株,从中筛选出无芽孢无荚膜且形体正常、菌体染色呈革兰氏阳性,菌落形态、菌体特征以及生长特性具有传代稳定性的菌株28株,其中8株菌株具有较强的产酸能力和较快的产酸速度。经鉴定,8株菌株中的SQ0012菌株为Lactobacillusplantarum（植物乳杆菌）,SQ0015菌株为Lactobacillus brevis（短乳杆菌）,SQ0030菌株为Enterococcusfaecalis（粪链球菌）,SQ0041菌株为Enterococcus fecalis（粪链球菌）,SQ0045 菌株为Lactobacilluskitasatonis（卡氏乳杆菌）,SQ0048菌株为 Lactobacillus johnsonii（约氏乳杆菌）,SQ0049菌株为Lactobacillus amylovorus（食淀粉乳杆菌）,SQ0054菌株为Lacoccus garvieae（格氏乳球菌）,其中SQ0030与SQ0041菌株同属同种菌株,保留SQ0030,最终认定7株为益生乳酸菌菌株。鉴定的7株菌株中,SQ0048及SQ0054菌株产酸能力较强,产酸速度最快而SQ0048还具有产过氧化氢的特性。SQ0048对金黄色葡萄球菌的抑制圈直径为11±0.5 mm,具有强抑制作用,SQ0054菌株为8±0.89 mm,具有轻度抑制作用,SQ0054菌株抑菌圈直径显著小于青霉素（P<0.05）,而SQ0048菌株抑菌直径与青霉素组相比较,无显著性差异（P>0.05）;对大肠杆菌抑制圈直径,SQ0048菌株为13±0.45 mm,具有强抑制作用,SQ0054菌株为10±0.2 mm,具有轻度抑制作用。SQ0048、SQ0054菌株的抑菌直径显著大于链霉索（P<0.05）。综上可见SQ0048、SQ0054菌株的益生特性均优于其他菌株。2.为了深入分析SQ0048及SQ0054发挥抗菌作用的主要成分,采用分子生物学方法克隆并表达了 SQ0048和SQ0054的抗菌肽基因,同时对抗菌肽基因表达物的抑菌性能进行研究。结果显示:SQ0048和SQ0054菌株的抗菌肽基因均得到了成功克隆并表达,SQ0048阳性克隆菌株与Lactobacillusjohnsonii NCC 533（NC005362.1）同源性为100%,表达后重组质粒与Lactobcillus johnsonii NCC 533（NC005362.1）同源性为 100%。SQ0054阳性克隆菌株与Lactococcus garvieae Lg2（12479992）同源性为95%,表达后重组质粒与Lactococcus garvieae Lg2（12479992）同源性为100%。对金黄色葡萄球菌,SQ0048抗菌肽表达产物为15±0.45 mm,具有非常强抑制作用;SQ0054抗菌肽表达产物为11±0.8 mm,具有强抑制作用。SQ0048抗菌肽表达产物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著大于SQ0054抗菌肽表达产物（P<0.05）,极显著大于PBS（P<0.01）,与青霉素相比较,则无显著性差异（P>0.05）。对大肠杆菌抑制圈直径,SQ0048抗菌肽表达产物为18±0.60 mm,具有非常强抑制作用;SQ0054抗菌肽表达产物为13±0.5 mm,具有强抑制作用。SQ0048抗菌肽表达产物对大肠杆菌的抑菌圈直径极显著大于SQ0054抗菌肽表达产物、PBS、链霉素（P<0.01）。综上可看出,SQ0048菌株抗菌肽基因表达物的抑菌能力优于SQ0054菌株抗菌肽基因表达物的抑菌能力,具有较强的抑菌作用。3.为了深入探讨SQ0048及SQ0054菌株的益生作用的分子机制,开展了下列研究:（1）采用原代细胞分离与培养技术,分离、培养并纯化了奶牛阴道上皮细胞;采用形态学、免疫荧光以及PCR鉴定方法,对其进行了鉴定;采用流式细胞术检定了细胞纯度;采用RTCA系统对细胞的生长特性进行了监测;利用单因素法确定了细胞冻存最佳条件。结果显示,所分离、培养及纯化的奶牛阴道上皮细胞形态多为扁平多角形或短梭形（铺路石状）,界限比较清晰,胞浆饱满,细胞核清晰可见,呈圆形,符合上皮细胞形态学特点。所取阴道组织样本细胞经免疫荧光鉴定,细胞核呈蓝色,胞质丰富呈红色,显示细胞角蛋白CK-18呈阳性,细胞角蛋白CK13基因表达量与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）,证明所分离、纯化的细胞为奶牛阴道上皮细胞。经纯化的细胞纯度为94%。当细胞接种密度在1.63×104个/mL时,生长曲线状态最佳,呈平稳上升的趋势,细胞冻存液中胎牛血清与DMSO比例在9:1时,冻存后活化活细胞数量较多,且活化后的细胞状态较好,并可传代培养。此为深入开展SQ0048菌株对奶牛阴道上皮细胞中TLRs-MyD88/NF-κB信号通路影响的研究奠定了良好的试验基础。（2）采用RT-qPCR方法,分析了 SQ0048菌株对奶牛阴道上皮细胞中TLRs-MyD88/NF-κB信号通路的调节作用,确定了 TLR4、TLR2及TLR4、MEKK1、IKK、NF-κB抑制剂的最佳作用浓度及作用时间,同时利用CCK-8法检测了最佳作用浓度及作用时间下的抑制剂及中、高、低浓度下SQ0048菌株对奶牛阴道上皮细胞的毒性作用,证实抑制剂及SQ0048菌株对奶牛阴道上皮细胞均无显著毒性作用。（3）采用RT-qPCR、ELISA及western blot方法,测定了SQ0048作用奶牛阴道上皮细胞后对TLRs-MyD88/NF-KB信号通路的影响。结果显示,中浓度SQ0048菌株可通过激动TLR2、TLR4,上调MyD88、MEKK1、IKK、NF-κB因子的表达,对TLR2/TLR4的介导NF-κB信号通路产生影响,提示SQ0048乳酸菌菌株可通过TLR2/TLR4的介导NF-κB信号通路发挥其生物学功能。中浓度SQ0048菌株激动NF-κB后,能够上调IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达,下调IL-10的表达。结论:SQ0048菌株具有较强的产酸能力,较快的产酸速度和具有产过氧化氢的益生作用;SQ0048菌株及其表达产物抗菌肽对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有显著的抑制作用;SQ0048的益生作用与其激动经由TLR2及TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路,上调IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达,下调IL-10的表达有关。