日本血吸虫病预防主要在致病,感染和传播三个方面,由于没有临床可用的抗血吸虫病疫苗,化学治疗联合消灭中间宿主钉螺等方法的综合治疗是目前控制血吸虫病的主要措施。吡喹酮是血吸虫病化疗的首选,由于其毒副作用小,价格低廉,杀血吸虫效果较好,因而该药被临床或是疫区预防广泛使用。但是其具体作用机制仍不明确,但是对慢性血吸虫病患者的治愈率低,广泛应用带来的耐PZQ血吸虫株报道时有出现。因此,加强抗血吸虫化疗药物的研制或新的药物作用靶点寻找刻不容缓。虫卵沉积致肉芽肿是日本血吸虫病最为主要致病因素,干预虫卵产生成为抗血吸虫病的重要途径之一。儿茶酚胺类物质是虫体本身重要的神经递质,主要分布于神经节,神经干等处酪氨酸经过一系列酶促反应生成儿茶酚胺类物质,其中合成的限速酶是酪氨酸羟化酶( tyrosine hydroxylase,TH),通过复杂的途径调控儿茶酚胺类物质的合成,据报道,人14-3-3信号蛋白可以上调TH的表达,增强酶活性。在曼氏血吸虫中,儿茶酚胺类物质与五羟色胺相互作用,影响曼氏血吸虫的肌肉收缩和产卵率。那么在日本血吸虫中是否存在儿茶酚胺类物质?是否有儿茶酚胺类物质合成的限速酶——酪氨酸羟化酶存在?是否存在不同信号通路调节酶的表达和/或活性?为此,本研究设计了一系列实验验证、分析上述推断,最终试图干预儿茶酚胺的合成,影响虫体的发育、虫卵产生及活动度等。我们对不同物种(人,牛,大鼠,小鼠,鹌鹑,果蝇和曼氏血吸虫)TH进行同源性比较,发现在近3′端同源性高。选择保守区内SmTH CDS序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RT-PCR扩增SjTH中间片段,获得一个497bp的片段,经测序证实该中间片段与SmTH同源性达到87%,初步认为该序列为SjTH的一部分;进一步以此中间片段设计引物,通过RACE PCR分别扩增SjTH的5′端和3′端,并测序、拼接,发现两端中间重叠片段与我们上述扩增的中间片段一致。利用NCBI提供的ORF finder在线分析拼接的SjTH序列,发现最长的SjTH长1392bp。据此ORF,设计用于扩增全基因的引物,再次进行PCR扩增,产物测序,两次结果一致,因此我们运用RACE PCR成功获得了SjTH的全编码基因序列,该基因全长1392bp,Vector NTI生物软件预测其编码SjTH含有463个氨基酸,分子量53.97kDa,pI为5.81,分别再次作上述的同源性比较,与SmTH的同源性达75%,与人类TH为40%。同SmTH一样,SjTH的保守区多位于近3′末端,在羧基末端存在一个14-3-3信号蛋白与靶蛋白相互作用的共同基序(RSXpSXP),因此,推测rSjTH可以与14-3-3相互作用。利用原核表达系统(pET28a/ BL21)表达出重组SjTH,His标签纯化融合蛋白,His单克隆抗体Western blotting分析蛋白免疫特性。用H3标记酪氨酸作为底物分析酶活性,发现rSjTH催化活性也需要二氢叶酸还原酶存在,且酶活性与二氢叶酸还原酶的量在一定范围内相关。同时制备rSjTH的多克隆抗体, IIF分析发现虫体内SjTH主要位于生殖器官,神经节和肌层。RT-PCR和Western blotting分析尾蚴和成虫(雌雄成虫)两种不同发育阶段的SjTH表达显示,SjTH在日本血吸虫成虫阶段表达量最高,其次是尾蚴,雌雄成虫间表达无差异。综上所述,我们成功扩增出SjTH编码基因,初步分析SjTH蛋白氨基酸组成,同源性,酶活性,定位及在不同生活史阶段表达变化。在蛋白近3′端发现与Sj14-3-3相互作用的一致性motif,推测该酶可以Sj14-3-3相互作用,为寻找调节酶活性变化的靶位奠定基础。吡喹酮(PZQ)是目前用于杀血吸虫治疗中应用最为广泛的特效药物,但有报道显示,该药对成虫的效果优于童虫,对成熟虫卵的效果优于未成熟虫卵,且杀虫治疗并不能阻止虫卵肉芽肿导致的肝脏纤维化的进展。此外,抗虫治疗后并不能预防再感染。曼氏血吸虫对PZQ抗药性的产生使日本血吸虫病的有效治疗面临极大的威胁。因此,新的抗血吸虫药物研究仍是十分重要的领域。血吸虫寄生在宿主的需氧环境,如肝脏,肺和血液等。因此,NIH化学基因组学研究中心筛选了能够抗氧化的化学复合物,发现两种化合物,即phosphinic amides和oxadiazole 2-oxides(OX),它们的共同作用是抑制谷胱甘肽还原酶( thioredoxin glutathione reductase,TGR)活性。OX作用范围窄,主要对曼氏血吸虫有效;钙通道阻滞剂被用来抑制血吸虫雌虫产卵,抑制雌虫产卵不仅有效阻止了血吸虫病肝纤维化的发展,也能有效减少传染源,阻断血吸虫病的传播。因此,抑制成虫成熟和雌虫虫卵的药物是抗血吸虫新药研发的重要切入点。虫卵在肝脏沉积,毛蚴释放的可溶性虫卵抗原( soluble eggs antigens,SEA)刺激机体引起的虫卵肉芽肿是血吸虫病患者致病最为重要的危险因素。儿茶酚胺类(catecholamine, CA)物质是高等动物重要的神经递质,也是血吸虫发育、寄生和附着的重要的神经递质,可以降低肌肉紧张度,抑制雌虫产卵。酪氨酸在限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)等一系列酶促反应作用下生成CA,其中限速酶TH是CA合成的调节点。在前述的研究中,我们在日本血吸虫成虫中成功克隆出SjTH的编码基因,序列分析SjTH发现在羧基端存在Sj14-3-3结合的通用基序( motif )即“RSXpSXP”的短肽——YIRHHSRPMHTP。人工合成该磷酸化的短肽( phosphorylated YIRHHSRPMHTP),经BIAcore分析显示,该磷酸化的短肽可以与Sj1-3-3信号蛋白特异性结合,推测Sj14-3-3可以与磷酸化的SjTH相互作用,这种相互作用是通过上述基序介导的。那么这种相互作用对TH活性是否有影响?已有报道:人类14-3-3和磷酸化的hTH相互作用后,hTH活化,活性增强,催化Tyr合成CA增加。在无脊椎动物日本血吸虫体内,这种相互作用是否会产生同样结果,尚不得而知。因此,我们在克隆出SjTH的基础上,体外真核表达了SjTH,磷酸化后与重组Sj14-3-3相互作用,3H标记Tyr分析了SjTH酶活性变化。根据前述克隆的SjTH编码序列,设计pcDNA3.1(his-myc)表达系统引物,真核表达SjTH,利用his标签纯化融合蛋白,体外磷酸化SjTH,加入不同浓度的Sj14-3-3信号蛋白,SjTH活性在一定范围内随Sj14-3-3蛋白的加入,活性增强。上述实验初步证明Sj14-3-3可以通过通用motif与SjTH结合,激活SjTH酶活性,终使儿茶酚胺类物质合成增加。这为下一步把SjTH和/或Sj14-3-3信号蛋白作为靶点,通过调节日本血吸虫儿茶酚胺类物质合成,进而干预日本血吸虫活动及雌虫产卵奠定基础。