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目的肺泡上皮细胞衰老是特发性肺纤维化发病进程中的重要机制之一。研究表明特发性肺纤维化(IPF)患者肺组织中的肺泡上皮细胞存在纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的高表达及PTEN的表达缺失,而PAI-1抑制剂也被少量研究证实可以在博来霉素诱导的大鼠肺泡上皮细胞衰老模型中发挥保护作用。本研究拟通过细胞学实验,研究PAI-1抑制剂在衰老肺泡上皮细胞的作用,并初步研究其作用机制,为在临床上应用PAI-1抑制剂治疗特发性肺纤维化提供初步的线索。材料与方法本实验共分三部分。第一部分:IPF患者肺组织及两种肺泡上皮细胞衰老模型中PTEN及PAI-1的表达拟通过对IPF移植患者的肺组织标本进行Western blot和免疫荧光的检测,验证IPF患者肺组织PTEN及PAI-1的表达水平及分布部位。并分别用博来霉素和H2O2诱导类Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549细胞)衰老模型,Western blot方法检测PTEN、PAI-1、P21WAF1及P16INK4A的表达。再用免疫共沉淀方法验证PTEN及PAI-1在A549细胞中存在相互作用。第二部分:PAI-1抑制剂及敲减PAI-1对衰老A549细胞的保护作用无血清培养A549细胞,予不同浓度PAI-1抑制剂预处理24小时,分别用博来霉素及H2O2处理细胞后,SA-β-gal染色方法检测A549细胞染色阳性率,Western blot 方法检测 A549 细胞中 PTEN、PAI-1、P21WAF1 及 P16INK4A 的表达。再用shPAI-1慢病毒转染A549细胞敲减PAI-1基因,Western blot方法检测敲减PAI-1后的A549细胞中PTEN、PAI-1、P21WAF1及P16INK4A的表达。第三部分:PAI-1抑制剂对敲减PTEN引起的A549细胞衰老的保护作用用shPTEN慢病毒转染A549细胞敲减PTEN基因,予5uM PAI-1抑制剂预处理24小时,分别用博来霉素及H2O2处理细胞,Western blot方法检测敲减PTEN 后的 A549 细胞中 PTEN、PAI-1、P21WAF1 及 P16INK4A 的表达。结果第一部分(1)IPF患者肺组织中PTEN表达下降,PAI-1及P21WAF1、P16INK4A的表达升高(P<0.05),免疫荧光结果提示PTEN及PAI-1的表达变化主要发生在肺泡上皮细胞中。(2)随着博来霉素及H2O2浓度的不断升高,A549细胞中PTEN表达逐渐下降,PAI-1 及 P21WAF1、P16INK4A 的表达逐渐升高(P<0.05)。(3)免疫共沉淀结果提示A549细胞中的PTEN和PAI-1存在蛋白相互作用。第二部分(1)用博来霉素及H2O2处理后,A549细胞PTEN的表达明显下降,PAI-1及P21WAF1、P16INK4A的表达明显升高(P<0.05),加用PAI-1抑制剂后,随着抑制剂浓度的升高,PTEN的表达逐渐回升,当PAI-1抑制剂达到5uM时,PTEN明显上调(P<0.05),PAI-1、P21WAF1表达的明显下降(P<0.05)。(2)SA-β-gal染色方法结果显示无药物处理对照组细胞SA-β-gal染色阳性率分别为14%±0.5774%和5.333%±0.4055%,博来霉素和H2O2处理后细胞SA-β-gal染色阳性率升高为70.33%±3.756%和83.48%±3.127%,使用5uMPAI-1抑制剂干预后SA-β-gal染色阳性率降至44.33%±2.906%和 58%±1.528%(P=0.0054),10uMPAI-1 抑制剂干预后 SA-β-gal 染色阳性率 58%±1.528%和 61.33%±4.096%(P<0.05)。(3)敲减 PAI-1 后,A549 中 PTEN 的表达上调(P<0.05),P21WAF1 及P16INK4A有下降趋势。当用博来霉素和H2O2处理后,敲减PAI-1组PAI-1及P21WAF1的表达明显下降(P<0.05),PTEN的表达有回升趋势,但是P16INK4A的表达变化无统计学差异。第三部分(1)敲减PTEN基因后A549细胞中PAI-1、P21WAF1及P16INK4A的表达明显升高(P<0.05),PAI-1 抑制剂可以使 PAI-1、P21WAF1 及 P16INK4A的表达下降,PTEN的表达回升(P<0.05)。当敲减PTEN基因的A549细胞用博来霉素及H2O2诱导,PAI-1抑制剂可使PAI-1、P21WAF1及P16INK4A的表达较药物处理前明显下降(P<0.05),但PTEN的上调不明显。结论(1)IPF是一种衰老相关疾病,IPF患者肺组织中PAI-1、P21WAF1、P16INK4A的表达升高,PTEN表达下降。(2)PTEN及PAI-1的表达变化主要发生在肺泡上皮细胞中,PTEN及PAI-1的变化可能与IPF病理过程中肺泡上皮细胞的衰老有关。(3)博来霉素和H2O2均能诱导A549细胞衰老,且衰老的A549细胞中PTEN的表达下降,PAI-1的表达升高。一定浓度范围内的PAI-1抑制剂可以减少博来霉素及H2O2诱导的A549细胞衰老。(4)敲减PAI-1可以上调PTEN,一定程度上减少博来霉素和H2O2诱导的A549细胞衰老。敲减PTEN可以诱导A549细胞衰老,PAI-1抑制剂可以减轻敲减PTEN引起的A549细胞衰老。(5)A549细胞中的PTEN和PAI-1存在蛋白相互作用。