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冠心病是临床上常见的心血管系统疾病之一,应当属于祖国传统医学中“胸痹”、“心痛”等范畴,中医认为其为本虚标实之证,本虚多为气虚,标实则多为血瘀。目前开展的中医药治疗冠心病疗效及作用机制研究,多为单一临床疗效评价,或药理作用机制研究,而较少从系统性研究角度,较为全面地,循序渐近地揭示中医药治疗冠心病的核心药物、有效法则、临床疗效、药理机制等。故本研究结合导师多年诊疗冠心病的临床实践经验,采用中医药文献数据挖掘方法,探索中医药治疗冠心病的用药规律,通过搜集整理《中华医典》收录的治疗冠心病名药,筛选出冠心病的主要治则治法为益气活血法,进而采用循证医学的系统评价方法,全面获取益气活血方药配伍治疗冠心病的临床随机对照试验研究,评估现代医家应用益气活血方药配伍治疗冠心病的临床疗效及其安全性,最终确定益气活血方药配伍治疗冠心病的代表药物黄芪、丹参,并分别提取两者有效成分黄芪甲苷、丹参酮IIA,采用细胞生物学,分子生物学等实验研究方法,观察其对分化后的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)间隙连接蛋白(Connexin protein,Cx)表达、缝隙连接通道(Gap junction channel,GJC)功能调节以及促新生血管生成能力的影响,以期为中医药治疗冠心病药物研发提供研究思路指导及有效干预措施。第一部分《中华医典·名药》收录治疗冠心病用药规律研究1.目的明确《中华医典·名药》胸痹心痛证治用药特点及主要治则治法。2.研究方法计算机检索《中华医典》光盘版(第5版)名药部分,以“胸痹”、“心痛”、“心悸”、“怔忡”、“冠心病”、“心绞痛”、“心肌缺血”、“冠状动脉硬化”等为检索词,检索方式为内容检索,通过制定严格纳入及排除标准,筛选及整理治疗胸痹心痛方药数据,建立Excel数据库,采用SPSS19.0软件统计分析。3.结果从《中华医典·名药》检索到264首方药约8万字的文献资料,依据纳入和排除标准,筛选出100首符合纳排标准的治疗冠心病方药,研究结果显示:①胸痹心痛治疗法则:以益气补虚、活血祛瘀为主;②治疗胸痹心痛单味中药使用频次:由高至低分别为丹参、黄芪、人参、川芎、冰片等;③治疗胸痹心痛中药功效:按功效分为16大类,补虚类中药高达(33%),其中以补气药所占比重最大(43%),其次为为活血化瘀类中药(14%);④治疗胸痹心痛单味中药性味归经:药味以甘(34%)、辛(30%)味为主。药性多以温热为主。归经主入心(23%)、脾(18%)、肝(18%)经。4.结论《中华医典·名药》收录治疗胸痹心痛前三位高频药物为丹参、黄芪、人参。其核心治疗法则为益气、活血,兼以理气,安神。第二部分益气活血方药配伍治疗冠心病的系统评价(Meta分析)1.目的评价益气活血方药配伍治疗冠心病的临床有效性及安全性。2.研究方法2.1计算机检索中国生物医学文献数据库(China Biology Medicine disc,CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)、维普期刊全文数据库(VIP)、Pubmed等中英文数据库(检索时间范围为2010-2014年)。采用循证检索策略及方法,全面获取益气活血方药配伍治疗冠心病的随机及半随机对照临床试验,通过制定严格的纳入及排除标准,准确筛选得到目标研究文献。2.2制定文献资料提取表,由双人独立提取研究基本情况、病患基本信息、合并病信息、干预措施、临床疗效指标等,不一致者由第三方专家组成员裁定。并采用改良Jadad量表评价研究文献质量。2.3采用Rev Man 5.3软件合并分析疗效指标效应量,系统评价益气活血方药配伍治疗冠心病的临床有效性。2.4采用描述性研究方法评价益气活血方药配伍治疗冠心病的临床安全性。3.结果3.1两名研究者逐一阅读所检索到的624篇文献资料,严格参照纳排标准共28篇合计病例2900例入选,其中治疗组1513例,对照组1387例。采用Rev Man 5.3软件分析得:在临床总疗效、中医证候疗效、心绞痛疗效、心电图疗效等指标改善率方面,西医常规治疗基础加益气活血方药配伍治疗冠心病,优于单纯西医常规治疗,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2分析以西医常规治疗消心痛为对照组的631例冠心病病例结果显示:西医常规治疗消心痛基础上加用益气活血方药配伍,与单纯消心痛为主的西医常规治疗相比较,其临床总疗效、心电图疗效合并OR[95%CI]值分别为3.74[2.08,6.74]、2.23[1.92,3.85],具有统计学差异(P<0.05),说明在西医常规治疗消心痛基础上加益气活血方药配伍的治疗组对冠心病临床总疗效、心电图疗效改善率,优于单纯以消心痛为主的西医常规治疗对照组。3.3分析以消心痛和阿司匹林联合运用的西医常规治疗为对照组的1877例冠心病患者,结果显示:在以消心痛及阿司匹林合用的西医常规治疗基础上加益气活血方药配伍,与单纯消心痛及阿司匹林合用的西医常规治疗比较,其临床总疗效、中医证候疗效、心绞痛疗效和心电图疗效合并OR[95%CI]值分别为4.48[3.25,6.19]、5.21[2.13,12.75]、2.77[1.57,4.88]、2.57[1.92,3.45],具有统计学差异(P<0.05),说明治疗组对冠心病临床总疗效、中医证候疗效、心绞痛疗效和心电图疗效改善,优于以消心痛和阿司匹林为主的西医常规治疗对照组。3.4对纳入研究的2900例冠心病病例进行不良反应/事件观察,益气活血方药配伍治疗组共出现5例不良反应/事件,均为恶心、呕吐等胃肠道反应,而单纯西医常规治疗组出现14例不良反应/事件,多表现为头晕、恶心、无力等症状。4.结论4.1在西医常规治疗基础上加用益气活血方药配伍治疗冠心病,在临床总疗效、中医证候疗效、心绞痛疗效和心电图疗效等方面,优于单纯以消心痛或消心痛及阿司匹林为主的西医常规治疗。4.2益气活血方药配伍治疗冠心病,不良反应较少。第三部分丹参酮IIA、黄芪甲苷及其配伍对MSCs细胞连接蛋白表达及促血管生成作用的研究1.目的从黄芪甲苷、丹参酮IIA及其配伍对MSCs连接通讯功能的调节角度,探讨此配伍是否通过间隙连接蛋白表达,调节连接通讯功能而促进血管生成,为益气活血方药配伍治疗冠心病提供实验依据。2.研究方法2.1采用全骨髓贴壁法分离培养乳鼠MSCs,获得原代MSCs,倒置显微镜下观察其形态,流式细胞仪鉴定MSCs表面分子,并将该细胞向内皮细胞诱导分化,然后采用免疫组化法观察诱导后细胞FⅧ因子表达。2.2诱导后的内皮样细胞随机分为如下4组并干预72小时:①空白组;②丹参酮IIA组;③黄芪甲苷组;④合用组。2.3分别采用实时定量PCR、Western blot检测诱导后MSCs细胞Cx37、Cx40、Cx43 m RNA及蛋白表达。2.4划痕实验检测内皮样细胞间隙连接通讯功能。2.5 MTT法检测诱导后内皮样细胞的增殖。2.6流式细胞仪检测诱导后内皮样细胞的细胞周期。2.7三维基质胶立体培养法检测内皮样细胞的毛细血管管状结构形成能力。3.结果3.1经过全骨髓贴壁法获得的细胞呈短梭形、纺锤形,流式细胞术检测提示CD44、CD90分子表达呈阳性,CD45、CD34分子表达呈阴性,证实提取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,经VEGF、b FGF诱导该细胞,并采用免疫组化法观察FⅧ因子表达,结果提示FⅧ因子相关抗原表达呈阳性,证实诱导后细胞为内皮样细胞。3.2实时定量PCR检测诱导后MSCs提示:益气活血合用组、丹参酮IIA组、黄芪甲苷组、空白组均可见Cx37、Cx40、Cx43m RNA的表达,其中合用组表达最强,丹参酮IIA组、黄芪甲苷组、空白组表达依次减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测诱导后MSCs的Cx37、Cx40、Cx43蛋白的表达合用组高于单用组,具有统计学差异(P<0.05),黄芪甲苷组略低于丹参酮IIA组,无统计学差异。3.3染料划痕实验发现:合用组荧光染料主要出现在划痕以外的3-4层细胞内且较为明显;丹参酮IIA组荧光染料则主要出现在划痕2-3层细胞中而且亮度较高;黄芪甲苷组荧光染料出现在划痕1-2层细胞中亮度较丹参酮IIA组略低;而空白组荧光染料主要出现在划痕1层细胞中且亮度最低。其中合用组强于丹参酮IIA组和黄芪甲苷组,后两组间差异无统计学意义。3.4 MTT法检测细胞增殖结果提示:合用组、丹参酮IIA组、黄芪甲苷组细胞增殖比例均高于空白组,合用组的增殖能力高于丹参酮IIA组与黄芪甲苷组,而丹参酮IIA组的增殖能力大于黄芪甲苷组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.5流式细胞仪检测细胞周期结果显示合用组、丹参酮IIA组、黄芪甲苷组细胞S期比例明显高于空白组,合用组高于单用组,单用组中丹参酮IIA组细胞S期比例高于黄芪甲苷组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.6三维基质胶立体培养法检测内皮样细胞的毛细血管管状结构形成能力,其结果显示:合用组、丹参酮IIA组、黄芪甲苷组均可见管状结构形成,其中合用组管状结构完整性及成管个数最好,空白组未见明显管状结构形成。4.结论黄芪甲苷、丹参酮IIA及其配伍均可提高诱导分化后MSCs细胞Cx37、Cx40和Cx43蛋白及m RNA的表达,调节细胞间隙连接通讯功能,从而促进血管的生成。