论文部分内容阅读
杨树生长迅速,是我国重要的生态和工业用材树种。基因工程的发展为杨树品种的遗传改良提供了新的技术方法,2002年转基因741杨获得林业生物基因工程安全委员会批准的商品化许可证书。杨树生命周期长,外源基因能否多年稳定表达并能遗传,成为影响转基因杨树栽培或作为杨树育种种质应用的重要因素。本文以大田栽植5年以上的转基因741杨和转基因三倍体毛白杨为试验材料,研究了外源基因在杨树基因组中的表达、整合位置、遗传规律以及对受体植株生长的影响等,并对转基因74l杨作为育种种质进行了探讨,主要结果如下:
1.对10a生转基因741杨基因组中BtCryIAc基因和NptⅡ基因的PCR检测表明,外源基因均稳定存在,未发现外源基因丢失现象。室内饲虫试验证明,转基因741杨各无性系对杨扇舟蛾和美国白蛾具有持续稳定的抗性,其高抗虫株系pb29和pb11对杨扇舟蛾1龄初孵幼虫的杀虫效果持续在85％～95%之间,对美国白蛾则基本在95%以上。未表现出有规律下降的趋势。
2.经过2年的调查发现,转基因741杨无性系pb11与受体741杨在进入开花年龄,以及果穗数量、长度、粗度以及每穗蒴果数、果穗脱落、自然结实率等方面均未表现出明显差异。数据表明,741杨与转基因741杨均高度不育,自然结实率低于3%。对试验林的生长调查表明,大汲店9a生转基因741杨无性系与易县毛白杨在高生长上差异不显著;pb17胸径生长量、材积生长量明显好于pb29和pb11。涿州7a生转基因741杨pb29与741杨在树高、胸径和材积生长上均无显著差异。
3.以转基因741杨为母本,84K杨为父本进行切枝杂交,结果表明:84K杨的花粉生命力在不同年份存在较大差异,简单的干燥处理和4℃低温保存仅能维持其生活力2～3d。转基因741杨的结实率在各无性系间差异显著,最高仅为11.8%。F1代种子萌发率和实际成苗率最高分别为18.5%和32.7%。通过胚培养,可提高F1代获得率,其最佳培养基为MS+6-BA0.1mg/L+IAA0.01mg/L+3%蔗糖,胚龄越长萌发率越高。杂交子代未能表现出杂种优势,生长弱于双亲,5年保存率为15.7%。
4.对F1代中的BtCryIAc基因和NptⅡ基因进行PCR扩增,结果表明:在杂交组合pb1x84K、pb11x84K和pb29x84K的F1代中,BtCryIAc基因PCR阳性植株与阴性植株的比例分别为1.31、1.15和0.86,经X2检验BtCryIAc基因符合由一对等位基因控制的1:1的孟德尔自由分离规律;NptⅡ基因也表现出同样的1:1的孟德尔遗传分离规律。pb6×84K的F1代中,外源BtCryIAc基因和NptⅡ基因的分离比,符合外源基因双位点插入时3:1的分离规律。BtCryIAc基因和NptⅡ基因在转基因741杨杂交后代中呈现紧密的连锁关系。
5.杂交子代在含卡那霉素的生根培养基上的筛选结果表明:pb1×84K杂交组合卡那霉素抗性株系:非抗株系符合1:1的分离规律;pb6×84K杂交组合符合3:1的分离规律。说明NptⅡ基因在转基因741杨杂交子代中可稳定表达,并且其遗传符合显性基因控制的孟德尔遗传。卡那霉素抗性在杂交子代株系间存在差异。pb6×84K子代中有1个株系,NptⅡ基因PCR结果呈阳性,但未表达卡那霉素抗性,呈现基因沉默现象。
6.利用流式细胞仪(PA)对转基因741杨(三倍体)及其杂交子代进行了染色体倍性检验。结果表明,在检测的18个F1代中,三倍体有4个,混倍体或近似三倍体有9个,二倍体有5个,其比例接近1:2:1。
7.用转基因741杨杂交F1代中含有BtCryIAc基因的株系,室内饲养杨扇舟蛾和美国白蛾,结果表明:转基因杂交后代可稳定获得其母本的抗虫基因,并能够稳定表达抗虫性,不仅可以使低龄幼虫致死,还可明显延缓幼虫的发育,并影响其正常化蛹。说明BtCryIAc基因为孟德尔显性遗传,抗虫性强的亲本,子代抗性也强,不抗虫的亲本产生的子代仍不具备抗虫性。但在同一家系中,不同子代间抗虫性存在差异。对转双抗虫基因741杨杂交后代不同家系进行Bt毒蛋白表达检测,也展现出同样的结果。
8.采用改进的TAIL-PCR方法,从3个转基因毛白杨植株中成功扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列。与杨树基因组比对显示,侧翼序列分别位于杨树基因组的第Ⅲ、第Ⅹ和第ⅩⅢ条染色体上。分析表明3个植株中T-DNA侧翼序列属于典型的T-DNA整合方式。T-DNA整合位点杨树基因组序列中AT含量低于其所在测序重叠群的平均AT含量1～8个百分点。